Entwicklung einer intravenös verabreichten synthetischen RNA-Virus-Immuntherapie zur Behandlung von Krebs

Nature Communications Band 13, Artikelnummer: 5907 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Die therapeutische Wirksamkeit intravenös verabreichter onkolytischer Viren (OVs) wird durch die Entwicklung neutralisierender Antikörperreaktionen gegen das Virus begrenzt. Um diese Einschränkung zu umgehen und eine wiederholte systemische Verabreichung von OVs zu ermöglichen, entwickeln wir hier synthetische RNA-Viren, die aus einem viralen RNA-Genom (vRNA) bestehen, das in Lipid-Nanopartikeln formuliert ist. Für zwei synthetische RNA-Virus-Medikamentenkandidaten, das Seneca-Valley-Virus (SVV) und das Coxsackievirus A21, demonstrieren wir die vRNA-Abgabe und -Replikation, den Virusaufbau, die Ausbreitung und die Lyse von Tumorzellen, was zu einer starken Antitumorwirksamkeit führt, selbst in Gegenwart von OV-neutralisierenden Antikörpern im Blutkreislauf. Die synthetische SVV-Replikation in Tumoren fördert die Infiltration von Immunzellen, die Umgestaltung der Tumormikroumgebung und erhöht die Aktivität des Anti-PD-1-Checkpoint-Inhibitors. Bei Mäusen und nichtmenschlichen Primaten wird synthetisches SVV gut vertragen und erreicht eine Exposition, die deutlich über dem Bedarf für eine Antitumoraktivität liegt. Insgesamt bietet die Plattform für synthetische RNA-Viren einen Ansatz, der die wiederholte intravenöse Verabreichung einer viralen Immuntherapie ermöglicht.

Onkolytische Viren (OVs) sind eine attraktive Krebstherapiemethode, die selektiv Tumorzellen abtötet und die Tumormikroumgebung (TME) entzündet. Die Kombination von OVs mit Krebsimmuntherapien hat das Potenzial, den Umbau des TME und die Aktivierung von Immunzellen zu fördern und so den Nutzen von Immun-Checkpoint-Inhibitoren (ICIs) bei schlecht oder nicht ansprechenden Tumoren zu erhöhen. Bisher war der therapeutische Nutzen der onkolytischen Virotherapie auf die intratumorale Verabreichung beschränkt, was eine systemische Antitumor-Immunantwort erfordert, um gegen nicht injizierte Läsionen wirksam zu sein. Talimogen laherparepvec (Imlygic®)1 hat bei intratumoraler Verabreichung bei Melanompatienten dauerhafte Reaktionen gezeigt, ebenso wie Coxsackievirus A21 (CAVATAK®)2. Die intravenöse (IV) Verabreichung von OVs kann die Wirksamkeit steigern, indem alle Tumorstellen, einschließlich kleiner metastatischer Läsionen, den OVs ausgesetzt werden. Die schnelle Entwicklung neutralisierender Antikörper gegen das Virus nach intravenöser Verabreichung begrenzt jedoch wahrscheinlich die Exposition und Infektion von Tumorzellen nach wiederholter Gabe3,4.

Um das Potenzial der viralen Immuntherapie zu maximieren, müssen Strategien zur Vermeidung einer Neutralisierung entwickelt werden. Retargeting5,6, Zellträger7,8, Beschichtung mit Polymeren9,10,11 und Liposomen12,13 wurden eingesetzt, um OVs vor neutralisierenden Antikörpern zu schützen, aber keine davon hat sich in der Klinik bewährt. Fortschritte in der Nanotechnologie und deren Einsatz zur Bereitstellung von Nukleinsäuren ebnen den Weg für neue Trägersysteme, um die Herausforderungen der intravenösen Verabreichung von OVs zu meistern14,15.

Hier beschreiben wir die Entwicklung einer nanopartikelbasierten Verabreichungsplattform, die die wiederholte intravenöse Verabreichung viraler Immuntherapien ermöglicht. Plasmid-Templates werden für die In-vitro-Transkription (IVT) von RNA-Virusgenomen (vRNA) entwickelt und optimiert, die bei der Formulierung in Lipid-Nanopartikeln (LNP) den Partikeln die gewünschten biophysikalischen Eigenschaften verleihen, um eine wiederholte IV-Verabreichung zu unterstützen. Da alle Komponenten synthetisch sind; Wir bezeichnen diese Modalität als synthetisches RNA-Virus.

Für diese Studie wählen wir zwei Picornaviren aus, das Seneca-Valley-Virus (SVV) und das Coxsackievirus A21 (CVA21), mit gut dokumentierter onkolytischer Aktivität und klinischer Sicherheit2,16,17,18,19. Ihre Genome bestehen aus einzelsträngiger RNA mit positivem Sinn und reichen aus, um den viralen Lebenszyklus einzuleiten, nachdem sie in eine permissive Tumorzelle eingeführt wurden. Diese Studie berichtet über die vRNA-Abgabe und -Replikation von Synthetic-SVV und Synthetic-CVA21. Wir zeigen, dass synthetische Viren gut verträglich sind und in mehreren Tumormodellen eine tumorselektive Virusproduktion und -verbreitung zeigen, was zu Onkolyse und Antitumorwirksamkeit führt. Wir gehen davon aus, dass diese Therapieplattform die mit der wiederholten intravenösen Verabreichung verbundenen Einschränkungen beseitigen und das therapeutische Potenzial von OVs verbessern wird.

Um neutralisierende Antikörper zu umgehen, die die Aktivität von intravenös verabreichten OVs hemmen, haben wir synthetische RNA-Viren für die systemische Abgabe von vRNA an Tumorzellen entwickelt. Sobald die vRNA/LNP internalisiert und im Zytoplasma einer Tumorzelle freigesetzt ist, repliziert sich die vRNA und erzeugt einen Ausbruch infektiöser Virionen, die sich lokal ausbreiten und benachbarte Tumorzellen abtöten, was die Rekrutierung von Immunzellen für das TME fördert (Abb. 1). ). Picornavirale SVV- und CVA21-vRNA-Konstrukte wurden in vitro und in vivo auf ihre Fähigkeit zur Virusproduktion validiert (ergänzende Abbildungen 1 und 2). Anschließend optimierten wir eine LNP-Formulierung für die intravenöse Verabreichung mit den gewünschten biophysikalischen Eigenschaften: geringe Größe (85 nm), monodispers und hohe Verkapselungseffizienz (ergänzende Abbildung 3a).

Das synthetische RNA-Virus besteht aus IVT-produzierter vRNA, die in einem LNP eingekapselt ist. In Tumorzellen rekapituliert vRNA alle Phasen des viralen Lebenszyklus, sodass sie sich repliziert und eine Welle infektiöser Virionen erzeugt, die sich lokal ausbreiten, Tumorzellen infizieren und abtöten und dadurch Immunzellen für das TME rekrutieren.

Um sicherzustellen, dass die vRNA-Replikation nach der Polyproteintranslation initiiert wird, müssen die Termini der IVT-vRNA denen des RNA-Virusgenoms entsprechen. Diese Termini werden während der IVT durch ein optimiertes 5‘-Ribozym und eine Runoff-Matrize erzeugt, die durch Spaltung durch ein Restriktionsenzym vom Typ IIS an den 3‘-Termini erzeugt wird. Um die Wirksamkeit von Synthetic-SVV zu steigern, haben wir Modifikationen an der internen Ribosomeneintrittsstelle (IRES)20 und eine Mutation in VP2 eingeführt, die den Viruseintritt verbessert21. Diese Modifikationen steigerten die Wirksamkeit im Vergleich zur SVV-001-vRNA22 (ergänzende Abbildung 3b, c). Am Ende der Studie wurde die SVV-Replikation in Tumorzellen und nicht im Lebergewebe nachgewiesen (ergänzende Abbildung 3d), was darauf hinweist, dass die systemische Verteilung von vRNA/LNP zur Virusreplikation in permissiven Tumorzellen und nicht in gesunden Geweben führte.

Die Verabreichung von synthetischem SVV führte zu einer signifikanten Tumorwachstumshemmung (TGI) von NCI-H446-Xenotransplantaten für kleinzelligen Lungenkrebs (SCLC) (Abb. 2a), einschließlich einer Regression sehr großer Tumoren (> 500 mm3, ergänzende Abb. 4a) ohne signifikanten Körper Gewichtsverlust (Abb. 2b). Die Verabreichung von Synthetic-SVV-Neg (einer replikationsinkompetenten vRNA) hemmte das Tumorwachstum nicht (Abb. 2a), was zeigt, dass TGI mit der SVV-Replikation assoziiert ist. Drei Tage nach der IV-Injektion von Synthetic-SVV- oder SVV-Virionen als Positivkontrolle wurde ein robustes Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungssignal (FISH) im Tumor sowohl vom Positiv- als auch vom Negativ-RNA-Strang nachgewiesen (ergänzende Abbildung 4b). Der Nachweis von Negativstrang-RNA, einer Vorlage für das Positivstrang-RNA-Genom des Picornavirus, bestätigt eindeutig die virale RNA-Replikation. In Tumoren von Mäusen, denen nicht replizierendes synthetisches SVV-Neg verabreicht wurde, wurden nur geringe Mengen an Positivstrang-RNA nachgewiesen, was wahrscheinlich mit restlicher vRNA/LNP in Blutgefäßen verbunden ist (ergänzende Abbildung 4b).

a–d Athymische Nacktmäuse, denen subkutan NCI-H446-SCLC-Xenotransplantattumoren implantiert wurden. a, b Mäuse wurden an den Tagen 1, 8 und 15 durch intravenöse Verabreichung entweder mit Vehikelkontrolle (PBS), Synthetic-SVV-Neg oder Synthetic-SVV in einer Menge von 1,0 mg/kg (n = 8 pro Gruppe) behandelt. a Tumorvolumen (mm3) und b Körpergewichtsveränderungen (%) wurden überwacht. Das Tumorwachstum (mm3) und die Körpergewichtsveränderungen (%) wurden überwacht. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung angegeben. Die statistische Signifikanz wurde unter Verwendung eines gemischten linearen Modells bestimmt ***p < 0,001 vs. PBS und ^^^p < 0,001 vs. Synthetic-SVV-Neg. c, d Replikation von synthetischem SVV in NCI-H446-Tumoren nach einer einzelnen IV-Dosis von 0,1 mg/kg SVV. c SVV-Negativstrang-RNA-Spiegel wurden mittels RT-qPCR bestimmt (n = 5 pro Zeitpunkt). SVV-Infektionspartikel (PFU) wurden durch Plaque-Assay bestimmt. n = 3 unabhängige Tumorproben wurden pro Zeitpunkt beurteilt. d FISH-spezifisch für SVV-positive (rot) und negative (weiß) RNA-Stränge werden für NCI-H466-Tumorabschnitte angezeigt. Die Kerne wurden mit 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) markiert. Diese Bilder sind repräsentativ für vier unabhängige Proben. Der Maßstab des Panels ist unter dem Bild angegeben. e, f Athymische Nacktmäuse (n = 7 pro Gruppe), denen subkutan SK-MEL-28 menschliche Melanomtumoren implantiert wurden, wurden durch intravenöse Verabreichung entweder mit Vehikelkontrolle (PBS) oder synthetischem CVA21 an den Tagen 1 und 8 in zwei verschiedenen Dosen behandelt. 0,2 mg/kg oder 0,05 mg/kg. e Tumorwachstum (mm3) und f Körpergewichtsveränderungen (%) wurden überwacht. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung angegeben. Die statistische Signifikanz wurde unter Verwendung eines gemischten linearen Modells ***p < 0,001 vs. PBS bestimmt. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Um die Dosis-Wirkungs-Beziehung nach intravenöser Verabreichung von Synthetic-SVV zu untersuchen, führten wir eine Dosistitration durch. Bei allen Dosierungen wurde ein starker TGI von NCI-H466-Xenotransplantat-Tumoren beobachtet, wobei der maximale TGI mit 0,1 mg/kg oder mehr erreicht wurde (ergänzende Abbildung 4c). Daher wurde eine Dosis von 0,1 mg/kg ausgewählt, um die Virusreplikationskinetik zu charakterisieren. Nach einer einzelnen intravenösen Verabreichung von Synthetic-SVV wurden die Tumoren zu mehreren Zeitpunkten entnommen und mittels RT-qPCR und FISH analysiert. Virale Negativstrang-RNA und intratumorale Virionen wurden bereits nach 3 Tagen nachgewiesen und erreichten bei den meisten Tumoren 7 Tage nach der Behandlung ein Plateau. Bemerkenswerterweise wurde eine anhaltende SVV-Replikation bis zu 21 Tage nach der Verabreichung einer einzelnen niedrigen Dosis synthetischen SVV festgestellt (Abb. 2c). Diese Ergebnisse wurden größtenteils mit dem FISH-Nachweis von SVV-positiven und -negativen RNA-Strängen rekapituliert, wobei das FISH-Signal im Tumor weit verbreitet war und am 10. Tag seinen Höhepunkt erreichte (Abb. 2d).

CVA21 wurde aufgrund seiner onkolytischen Eigenschaften, seiner günstigen IV-Verträglichkeit bei Krebspatienten2,23,24 und seines ausgeprägten Tumortropismus im Vergleich zu SVV16,24 als zweiter Kandidat für ein synthetisches RNA-Virus ausgewählt. CVA21 IVT transkribierte vRNA, formuliert mit der gleichen Lipidzusammensetzung wie für Synthetic-SVV, ergab Nanopartikel mit ähnlich wünschenswerten biophysikalischen Eigenschaften. Im SK-MEL-28-Melanommodell (Abb. 2e) wurde bei niedrigen Dosierungen eine vollständige Tumorregression ohne signifikanten Körpergewichtsverlust beobachtet (Abb. 2f).

Die Verträglichkeit des synthetischen SVV-Virus wurde bei immunkompetenten A/J-Mäusen untersucht, die gegenüber einer SVV-Infektion tolerant waren22. Die intravenöse Verabreichung von Synthetic-SVV in einer Menge von 3 mg/kg wurde gut vertragen, wenn sie A/J-Mäusen verabreicht wurde, die einen syngenen Neuroblastom-Tumor, N1E-11525, trugen. Es wurden keine signifikanten nachteiligen Veränderungen des Körpergewichts, klinische Anzeichen oder histopathologische Befunde beobachtet (ergänzende Abbildung 5a). Die Quantifizierung von OC mittels Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) zeigte eine breite LNP-Verteilung in allen analysierten Geweben 30 Minuten nach der Dosis (ergänzende Abbildung 5b), gefolgt von einer schnellen Clearance, was durch den fehlenden OC-Nachweis nach 24 Stunden belegt wurde. Es gab keine Veränderungen in der klinischen Chemie, einschließlich der Leberfunktion (ergänzende Abbildung 5c ​​– e). Es wurde ein vorübergehender Anstieg proinflammatorischer Zytokine beobachtet (ergänzende Abbildung 5f – j), wie für andere systemisch verabreichte LNPs berichtet, der jedoch nicht mit einer Komplementaktivierung einherging (ergänzende Abbildung 5k). Bei naiven A/J-Mäusen zeigte Synthetic-SVV eine minimale und vorübergehende Virusreplikation in Lunge, Milz und Leber (ergänzende Abbildung 5l).

Synthetisches CVA21 wurde auch von einer transgenen Maus, die das menschliche ICAM1-Gen (huICAM1), den zellulären Rezeptor für CVA21, exprimierte, gut vertragen und war bekanntermaßen empfindlich gegenüber einer CVA21-Infektion27,28. Die intravenöse Verabreichung von Synthetic-CVA21 führte zu keinen nachteiligen klinischen Symptomen (ergänzende Abbildung 6a). Die histopathologischen Befunde beschränkten sich auf leichte mikroskopische Veränderungen in der Leber, die hauptsächlich auf die Behandlung mit der LNP-Formulierung zurückzuführen waren. Geringe Mengen an CVA21-Replikation wurden 2 Tage nach der Dosierung mittels RT-qPCR und mittels Plaque-Titer-Assay in Milz, Leber, Lunge, Herz und Niere nachgewiesen. Negativstrang-RNA oder CVA21-Virionen waren jedoch nach 7 Tagen nicht mehr nachweisbar (ergänzende Abbildung 6b, c), was darauf hinweist, dass die Mäuse die CVA21-Infektion überstanden hatten. Diese Daten deuten darauf hin, dass Synthetic-SVV und -CVA21 in Mausmodellen, von denen bekannt ist, dass sie für diese Viren tolerant sind, bei Dosierungen, die über denen liegen, die zur Auslösung einer Tumorregression erforderlich sind, gut vertragen werden.

Die Verträglichkeit von synthetischem SVV wurde weiter bei nichtmenschlichen Primaten (NHP) untersucht, denen dreimal alle zwei Wochen 1 mg/kg synthetisches SVV verabreicht wurde. Es wurden keine klinischen Anzeichen und signifikante Auswirkungen auf das Körpergewicht beobachtet (ergänzende Abbildung 7a). Die pharmakokinetische Analyse der LNP-Lipidkomponente ergab, dass die im NHP-Plasma erreichte Exposition (AUC0-∞) das 85-fache der Exposition betrug, die bei athymischen Nacktmäusen erreicht wurde, denen im NCI-H446-SCLC-Modell die maximal wirksame Dosis verabreicht wurde (ergänzende Abbildung 4a und). Tabelle 1). Die systemische Verabreichung von Synthetic-SVV verteilte die vRNA 24 Stunden nach der dritten Dosis auf alle untersuchten Gewebe, einschließlich Milz, Leber, Niere, Muskel, Lunge und Gehirn (ergänzende Abbildung 7b), was die breite Bioverteilung des LNP-Lipids widerspiegelt Komponente, die bei tumortragenden Mäusen beobachtet wurde (ergänzende Abbildung 5b).

Darüber hinaus wurden bei NHP keine histologischen Befunde beobachtet. Es wurden nur geringfügige und vorübergehende Erhöhungen der Parameter der Leberchemie beobachtet (ergänzende Abbildung 7c – e). Die proinflammatorischen Zytokine im Plasma, einschließlich IL-6 und MCP-1, sowie die Komplementaktivität waren innerhalb von 2–24 Stunden nach der intravenösen Dosis vorübergehend erhöht (ergänzende Abbildung 7f – h). Diese Ergebnisse belegen die Verträglichkeit einer wiederholten Gabe von synthetischem SVV bei Javaneraffen in einer Dosis, die über die zur Auslösung einer wirksamen Antitumoraktivität erforderlichen Expositionen hinausgeht.

Wir gingen davon aus, dass die Abgabe von vRNA/LNP gegen im Umlauf befindliche virusneutralisierende Antikörper resistent wäre. Um diese Hypothese zu testen, immunisierten wir NCI-H466-tragende immungeschwächte Mäuse passiv entweder mit einem Kontrollkaninchenserum oder einem Kaninchen-Anti-SVV-Serum mit bestätigter Neutralisierungswirkung für SVV-001, SVV(S177A) und SVV(S177A-IRES2). ) Viren, wobei letztere durch die vRNA in Synthetic-SVV kodiert werden (ergänzende Abbildung 8a – c). Anschließend verglichen wir die Antitumorwirksamkeit von 0,1 mg/kg synthetischen SVV- oder SVV(S177A-IRES2)-Virionen (Abb. 3). Mit Kontrollserum behandelte Tiere, denen SVV (S177A-IRES2) oder synthetisches SVV verabreicht wurde, zeigten im Vergleich zur Vehikelkontrolle eine starke Antitumoraktivität. Im Gegensatz dazu war bei Mäusen, die mit Anti-SVV-Serum vorbehandelt wurden, die Wirksamkeit von iv verabreichtem SVV (S177A-IRES2) vollständig aufgehoben, während synthetisches SVV weiterhin wirksam das Wachstum von NCI-H466-Xenotransplantaten hemmte. Eine ähnliche Aufhebung der Aktivität des klinisch untersuchten SVV-001 wurde in Gegenwart neutralisierender Antikörper beobachtet, während synthetisches SVV aktiv blieb (ergänzende Abbildung 8d).

Die Antitumorwirksamkeit des vom synthetischen SVV abgeleiteten Virus SVV (S177A-IRES2) und des synthetischen SVV wurde anhand des Tumorvolumens (mm3) bei NCI-H446-tumortragenden Mäusen nach Injektion von Kontroll- oder neutralisierendem Anti-SVV-Kaninchenserum bewertet. Mäuse, die passiv mit SVV-Antiseren immunisiert wurden, erhielten 3 IV-Injektionen von entweder 106 PFU SVV(S177A-IRES2)-Virionen oder 0,1 mg/kg synthetischem SVV (n = 10 pro Gruppe). Die Daten werden als Mittelwerte +/− SEM dargestellt. Die statistische Signifikanz wurde mithilfe eines gemischten linearen Modells bestimmt. p < 0,001 vs. PBS, SVV(S177A-IRES2) und Kontroll-Ak. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Anschließend versuchten wir, die Aktivität von synthetischem SVV in Modellen zu bewerten, die möglicherweise repräsentativer für menschliches SCLC sind als die subkutanen Xenotransplantatmodelle. SCLC ist eine geeignete Indikation für die klinische Entwicklung von Synthetic-SVV, da SVV einen etablierten Tropismus für Tumoren neuroendokrinen Ursprungs aufweist16,22. Bei Mäusen, die orthotop in die Lunge implantierte NCI-H82-Tumoren trugen, lösten zwei intravenöse Verabreichungen von synthetischem SVV die SVV-Replikation aus (ergänzende Abbildung 9a) und verdoppelten nahezu das Überleben im Vergleich zu den Kontrollarmen (Abbildung 4a). Die Immunhistochemie (IHC) für den humanen Delta-ähnlichen Liganden 3 (hDLL3), einen neuroendokrinen Marker, der in NCI-H82-Zellen stark exprimiert wird (ergänzende Abbildung 9b), wurde zur Quantifizierung der Tumorlast eingesetzt. Die Untersuchung der 10 Tage nach der Behandlung entnommenen Gewebe ergab eine signifikante Verringerung der Tumorlast und eine ausgedehnte zentrale Tumornekrose in der Lunge von Mäusen, die mit synthetischem SVV behandelt wurden (Abb. 4b, c).

a–c NCI-H82-Tumoren wurden orthotopisch in athymische Nacktmäuse implantiert. Den Tieren wurde an den Tagen 15 und 22 nach der Tumorinokulation entweder PBS, 1,0 mg/kg Synthetic-SVV-Neg oder 1,0 mg/kg Synthetic-SVV verabreicht (n = 15 pro Gruppe). Eine Überlebensanalyse wurde mithilfe des Log-Rank-Tests (Mantel-Cox) bewertet, ***p = 0,003; ****p < 0,0001 vs. synthetisches SVV. b Morphometrische Analyse des hDLL3-positiven Bereichs von Lungen- und extrapulmonalem Gewebe, der von lebensfähigen Tumoren in der Lunge von Mäusen 10 Tage nach der Behandlung besetzt ist. Die statistische Signifikanz wurde mithilfe des zweiseitigen gepaarten T-Tests bestimmt, *p = 0,011; ***p = 0,0003. c Repräsentative Bilder der hDLL3-Färbung, ermittelt in 15 Einzelproben/Behandlungsarm. Die Maßstabsbalken oben links betragen 1000 µm. d NOD/SCID-Mäusen wurden SCLC-PDX-Tumoren (Crown Bioscience, San Diego, CA) subkutan implantiert und durch intravenöse Verabreichung entweder mit Vehikelkontrolle (PBS), Synthetic-SVV-Neg oder Synthetic-SVV 1 mg/kg an Tagen dosiert 1 und 8 (n = 8 pro Gruppe). Das Tumorvolumen (mm3) wurde zu verschiedenen Zeitpunkten überwacht. e RPM-Mäusen wurden subkutan SCLC-GEMM-Primärkulturzellen implantiert und ihnen wurde durch intravenöse Verabreichung entweder Vehikelkontrolle (PBS), Synthetic-SVV-Neg oder Synthetic-SVV 1 mg/kg an den Tagen 1 und 8 verabreicht (n = 8 pro Gruppe). ). Das Tumorvolumen (mm3) wurde zu verschiedenen Zeitpunkten überwacht. d, e Die Daten werden als Mittelwerte +/− SD dargestellt. Die statistische Signifikanz wurde unter Verwendung eines gemischten linearen Modells bestimmt, ***p < 0,001 vs. PBS und ^^p < 0,01; ^^^p < 0,001 vs. Synthetic-SVV-Neg. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Es wird angenommen, dass patienteneigene Xenotransplantate (PDX) und gentechnisch veränderte Mausmodelle (GEMMs) die Heterogenität und genetische Veränderung menschlicher Krebsarten besser darstellen29. Angesichts der Tatsache, dass SCLC für seine Heterogenität bekannt ist, die zur Entstehung behandlungsresistenter Erkrankungen und zum Wiederauftreten führt30,31,32, haben wir die Fähigkeit von Synthetic-SVV zur Replikation in einem SCLC-PDX-Modell bewertet. Mäuse, die ein SCLC-PDX-Modell trugen, erhielten intravenös eine Gabe von Synthetic-SVV, Synthetic-SVV-Neg oder Vehikel und intratumoral eine Gabe von SVV-001-Virionen als Positivkontrolle. Ähnliche Ausmaße der Virusreplikation wurden beobachtet, wenn synthetisches SVV systemisch verabreicht wurde oder SVV-001-Virionen intratumoral verabreicht wurden (ergänzende Abbildung 9c). Darüber hinaus wurde nach der Verabreichung von synthetischem SVV eine starke Antitumoraktivität beobachtet (Abb. 4d).

Tumoren, die aus GEMMs entstehen, ahmen die molekularen Merkmale, die Tumorheterogenität und die Histopathologie ihrer menschlichen Gegenstücke weitgehend nach. Wir untersuchten die Wirksamkeit von Synthetic-SVV in einem transplantierbaren SCLC-GEMM-Modell33 (Rb1fl/flTrp53 fl/flMyc LSL/LSL) mit histopathologischen und transkriptionellen Profilen, die denen des menschlichen SCLC ähneln. Synthetisches SVV hemmte das Tumorwachstum signifikant (Abb. 4e). Tumoren, die 5 Tage nach der Dosierung gesammelt wurden, zeigten ein hohes Maß an SVV-Replikation (ergänzende Abbildung 9d). Darüber hinaus haben wir die Veränderungen in der Immunmikroumgebung in diesem Modell mit dem Nanostring PanCancer IO 360™ Panel profiliert. Wir beobachteten bei Tumoren von Mäusen, die mit synthetischem SVV behandelt wurden, im Vergleich zur Vehikelkontrolle deutlich erhöhte Werte im Zusammenhang mit Zytotoxizität, Interferonsignalisierung und Signalwegen im Lymphkompartiment (ergänzende Abbildung 9e), was darauf hindeutet, dass die In-situ-SVV-Replikation zu stärker entzündetem TME führte.

Die durch synthetisches SVV hervorgerufene Veränderung des TME wurde im syngenen N1E-115-Tumor charakterisiert, einem Modell, das von Immunzellen schlecht infiltriert wurde (ergänzende Abbildung 10). Die Verabreichung von synthetischem SVV führte zu einem signifikanten Anstieg der Rekrutierung von CD8-T-Zellen und einem Trend zu CD4-T-Zellen und NK-Zellen (Abb. 5a und ergänzende Abb. 11a). Die Anzahl regulatorischer T-Zellen (Treg) stieg in Tumoren nicht an, was zu einem erhöhten CD8/Treg-Verhältnis führte, das mit einem verbesserten klinischen Nutzen der Anti-PD-1-Therapie in Verbindung gebracht wurde34 (Abb. 5b). Die CD8-T-Zellen zeigten einen aktivierten Phänotyp mit hochreguliertem CTLA4 und PD-1 (Abb. 5c). Sowohl kurzlebige Effektorzellen (SLEC, CD8+, CD127, KLRG1+) als auch Gedächtnisvorläufer-Effektorzellen (MPEC, CD8+, CD127+, KLRG1−) waren mit Synthetic-SVV im Vergleich zur Kontrolle erhöht (Abb. 5d). Tumorassoziierte Makrophagen wurden ebenfalls profiliert und ein erhöhtes Verhältnis von M1 (phagozytisch, CD206-CD86+)/M2 (proinflammatorisch, CD206+CD86−) beobachtet (Abb. 5e und ergänzende Abb. 11b). Die Anzahl der M1-Makrophagen (Abb. 5f) und Tumorzellen, die den PD-1-Liganden (PD-L1) exprimieren, war ebenfalls signifikant erhöht (Abb. 5g). Übereinstimmende Ergebnisse wurden erhalten, als Tumore mit dem NanoString PanCancer IO 360™ Panel analysiert wurden (Supplemental Data 1). Die Behandlung mit synthetischem SVV erhöhte die mit der Rekrutierung und Aktivierung von Immunzellen verbundenen Signalwege erheblich (ergänzende Abbildung 12). Diese Daten deuten darauf hin, dass synthetisches SVV die Rekrutierung von Immunzellen und die Antitumorimmunität fördert. Darüber hinaus führten zwei wöchentliche Dosen von Synthetic-SVV zu einem signifikanten TGI (ergänzende Abbildung 13).

a–g A/J-Mäuse (n = 5 pro Gruppe), denen subkutan syngene neuroendokrine N1E-115-Tumoren implantiert wurden. Mäuse wurden an den Tagen 1 und 8 durch intravenöse Verabreichung entweder mit PBS-Vehikelkontrolle oder 1 mg/kg synthetischem SVV behandelt. Die Tumore wurden 6 Tage nach der zweiten Dosis gesammelt. eine Anzahl von NK-, NKT-, CD4-, CD8- und Treg-Zellen pro mg Tumor. Für CD8 p = 0,0002 mit einem zweifaktoriellen ANOVA-Test b CD8/Treg-Verhältnis. c Anzahl der CD8-T-Zellen pro mg Tumor, die CTLA-4 oder PD-1 exprimieren. Für PD1 ist p = 0,01 mit einem zweifaktoriellen ANOVA-Test. d Anzahl der CD8-T-Zellen pro mg Tumor, die SLEC (CD127-KLRG1+) oder MPEC (CD127+-KLRG1−) sind. e Verhältnis von M1/M2-Makrophagen. p = 0,0002 mit einem zweiseitigen gepaarten Student-T-Test. f Anzahl der M1- und M2-Makrophagen PD-L1+ pro mg Tumor. p = 0,01 mit einem zweiseitigen gepaarten Student-T-Test. g Anzahl der CD45-PD-L1+-Zellen pro mg Tumor. p = 0,01 mit einem zweiseitigen gepaarten Student-T-Test. h A/J-Mäusen (n = 10 pro Gruppe) wurden N1E-115-Tumoren subkutan implantiert und durch intravenöse Verabreichung entweder mit Synthetic-SVV an Tag 1 und 8 (0,3 mg/kg) und durch IP-Verabreichung von Kontrollantikörpern (Maus-IgG2a) behandelt ) oder Anti-PD-1-Antikörper an den Tagen 1, 4 und 7 (200 µg), wie angegeben. Das Tumorvolumen (mm3) wurde überwacht. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung angegeben. Die statistische Signifikanz wurde mithilfe eines gemischten linearen Modells bestimmt, *p = 0,01 vs. IgG2a, *p = 0,03 vs. synthetisches SVV/IgG2a. h Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Die erhöhte Entzündung im TME und die Hochregulierung von PD-L1 auf N1E-115-Tumorzellen und tumorassoziierten Makrophagen lieferten einen starken Grund für die Kombination von synthetischem SVV mit einem PD-1-Antagonisten. Überraschenderweise ergab der Anti-PD-1-Antikörper bei diesem kalten Tumormodell einen mäßigen, aber signifikanten TGI, ähnlich einer suboptimalen Dosis von Synthetic-SVV; Ihre Kombination erbrachte jedoch eine deutlich höhere Wirksamkeit als jedes einzelne Mittel (Abb. 5h).

Dieser Bericht beschreibt das Design und die Entwicklung synthetischer RNA-Viren für die systemische Behandlung von Krebs. Die intravenöse Verabreichung der in LNPs formulierten vRNA-Genome für zwei Picornaviren, SVV und CVA21, wurde gut vertragen und löste eine tumorspezifische In-situ-Produktion von OVs, die Rekrutierung von Immunzellen und letztendlich die Tumorzerstörung aus. Die Wirksamkeit wurde in mehreren Krebsmodellen beobachtet, darunter Xenotransplantate, PDX, GEMM und syngene Modelle. Darüber hinaus wurde in einem orthotopen SCLC-Tumormodell ein Überlebensvorteil beobachtet. Synthetisches SVV blieb auch in Gegenwart zirkulierender virusspezifischer neutralisierender Antikörper wirksam und wurde durch die Kombination mit einem Inhibitor des Immun-Checkpoints PD-1 weiter verstärkt.

OVs im klinischen Stadium, einschließlich solcher mit keiner oder nur geringer vorheriger Exposition beim Menschen wie SVV, CVA21 oder Enadenotucirev, einem nicht natürlich vorkommenden Adenovirus, haben über eine Neutralisierung nach wiederholter intravenöser Gabe berichtet, was das Wirksamkeitsfenster wahrscheinlich auf einen kurzen Zeitraum begrenzt16. 17,23,35,36. Wir haben hier gezeigt, dass im Gegensatz zur In-vivo-Aktivität von SVV-Virionen die Aktivität von Synthetic-SVV auch in Gegenwart eines neutralisierenden SVV-Antikörpers wirksam blieb. Obwohl beide Behandlungen dasselbe virale Genom nutzen, ist es wichtig anzuerkennen, dass sich die Modalität des synthetischen Virus in Bezug auf Stabilität, Bioverteilung, endosomales Entweichen und anfänglichen Eintrittstropismus erheblich von der picornaviralen Variante unterscheidet; und doch reichte die an den Tumor abgegebene Dosis an synthetischem SVV immer noch aus, um in Gegenwart neutralisierender Antiseren eine starke Antitumorwirksamkeit hervorzurufen. Wir gehen davon aus, dass die Antikörperkonzentration im interstitiellen Tumormilieu nach der Abgabe des viralen Genoms und der Einleitung der Replikation in permissiven Tumorzellen nicht den erforderlichen Schwellenwert erreicht, um die Ausbreitung von Zelle zu Zelle während einer Virusinfektion zu hemmen. Diese Daten stehen im Einklang mit dem fehlenden Einfluss der Vorimmunisierung auf die präklinische und klinische Aktivität des onkolytischen HSV nach intratumoraler Injektion1,37. Daher wird erwartet, dass unsere Strategie die zentrale Herausforderung im Bereich der OVs bewältigt, indem sie eine wiederholte intravenöse Verabreichung ermöglicht und so allen Tumorläsionen innerhalb eines Patienten die Möglichkeit bietet, dem therapeutischen Wirkstoff ausgesetzt zu werden und gleichzeitig einer Neutralisierung zu entgehen. Schließlich gehen wir davon aus, dass die systemische Verabreichung synthetischer RNA-Viren Patienten mit disseminierter Erkrankung und Patienten zugute kommen wird, bei denen die Durchführung sicherer wiederholter intraläsionaler OV-Injektionen eine Herausforderung darstellt. Die Behandlung von Lungenkrebs ist in diesem Zusammenhang besonders interessant, da die beiden hier beschriebenen synthetischen RNA-Viren SVV und CVA21 einen Tropismus für SCLC bzw. NSCLC haben.

SVV hat einen bekannten Tropismus für SCLC17,22, und dies wird durch unsere Daten bestätigt, die eine Antitumoraktivität in mehreren SCLC-Modellen zeigen. Der CVA21-Tumortropismus wird durch die Expression seines Eintrittsrezeptors ICAM1 gesteuert, der bei NSCLC und anderen Tumorindikationen stark exprimiert wird38,39. Zusätzlich zu seinem Eintrittsrezeptor wird der virale Tropismus nach dem Eintritt auch durch Typ-I-IFN und virale Restriktionsfaktoren innerhalb der infizierten Zelle eingeschränkt. Diese müssen unbedingt im Zusammenhang mit der Plattform zur Abgabe synthetischer RNA-Viren berücksichtigt werden, da diese zunächst LNP verwendet, um den viralen Eintrittsrezeptor zu umgehen. Während die intravenöse Verabreichung des synthetischen RNA-Virus zu einer breiten Gewebeverteilung führte, wurde in normalen Geweben empfindlicher Mausstämme ein minimaler und vorübergehender Nachweis der SVV- oder CVA21-Replikation beobachtet. Diese Ergebnisse belegen die selektive Tumorreplikation und -eliminierung durch die antivirale Reaktion des Wirts in normalen Geweben. Insgesamt wurden synthetische RNA-Viren nach einer einzelnen oder mehreren intravenösen Dosen bei Mäusen und nichtmenschlichen Primaten gut vertragen, ebenso wie die mRNA/LNP-Formulierungen, die Proteintherapeutika kodieren, die von anderen in präklinischen40 und klinischen Studien41 beschrieben wurden.

Die Wirkungsweise von OVs beinhaltet die direkte Abtötung von Krebszellen und die Stimulierung der Antitumorimmunität42. Die Behandlung von SCLC und NSCLC könnte besonders von der wiederholten intravenösen Verabreichung von OV profitieren, wie sie durch die Plattform für synthetische RNA-Viren ermöglicht wird, da sichere intraläsionale Injektionen bei Lungenkrebs eine Herausforderung darstellen. SCLC und NSCLC sind bekannt für eine hohe Tumormutationslast43,44, für ihre Empfindlichkeit gegenüber Immun-Checkpoint-Inhibitoren und für ihre Fähigkeit, SVV bzw. CVA21 zu replizieren. Während die starke Antitumoraktivität des synthetischen RNA-Virus in menschlichen Tumormodellen, die in immungeschwächten Mäusen xenotransplantiert wurden, wahrscheinlich auf die ungehemmte Ausbreitung der Infektion innerhalb des Tumors und die Onkolyse zurückzuführen ist, kann die Infektion wahrscheinlich dadurch begrenzt werden, dass Immunzellen infizierte Zellen erkennen und eliminieren immunkompetenter Wirt. Die Immunerkennung der Virusreplikation kann wiederum die Wirksamkeit synthetischer RNA-Viren erleichtern, indem sie die Rekrutierung und Aktivierung von Immunzellen verbessert. Wie bei anderen OVs37 beobachtet, baute Synthetic-SVV das TME um und erhöhte die Anzahl der CD8-T-Zellen und M1-phagozytischen Makrophagen. Die Hochregulierung von PD-L1 auf Tumor- und myeloischen Zellen lieferte den Grund für die Kombination von synthetischem SVV mit Anti-PD-1 und zeigte einen verbesserten therapeutischen Nutzen gegenüber jeder Monotherapie. Der Nutzen der derzeit für die Behandlung von SCLC und NSCLC zugelassenen PD-(L)1-Antagonisten ist auf einen kleinen Prozentsatz der Patienten beschränkt; Unsere Daten legen nahe, dass die Kombination mit synthetischen RNA-Viren die Ergebnisse bei diesen Patienten verbessern kann.

Synthetische RNA-Viren stellen eine therapeutische Modalität für die Krebsbehandlung dar und haben das Potenzial, das derzeitige intraläsionale Injektionsparadigma für OVs in eine bequeme intravenöse wiederholte Verabreichung umzuwandeln. Diese Modalität hat das Potenzial, alle Tumorläsionen eines Patienten einem wirksam onkolytischen lebenden Medikament auszusetzen, das Tumore infizieren und sich in ihnen ausbreiten kann, während es gleichzeitig Anti-Tumor-Immunreaktionen stimuliert. Synthetic-SVV und Synthetic-CVA21 zeigen in präklinischen Modellen eine starke Aktivität, selbst in Gegenwart neutralisierender Antikörper, und werden von Nagetieren und nichtmenschlichen Primaten gut vertragen. Diese Daten unterstützen den Fortschritt von Synthetic-SVV und -CVA21 in klinischen Studien zur Behandlung von Lungenkrebs und anderen zulässigen Tumorindikationen als Monotherapie oder in Kombination mit ICIs-haltigen Standardbehandlungsschemata.

Alle experimentellen Verfahren in Tiermodellen, einschließlich Mäusen und nichtmenschlichen Primaten, wurden von den jeweiligen Institutional Animal Care and Use Committees überprüft und genehmigt und folgten den NIH-Richtlinien, wie im Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, 8. Auflage, angegeben. NHP-Studien wurden in einer von der Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC) akkreditierten Einrichtung durchgeführt.

RT-qPCR wurde mit dem Echtzeit-PCR-System QuantStudio 6 Pro von ThermoFisher (Applied Biosystems) gesammelt. Immunhistochemische (IHC) Schnitte wurden mit dem Hamamatsu Nanozoomer digital gescannt, das bildgebende Zytometer Spectra Max i3X Minimax wurde zur Quantifizierung der Fluoreszenz verwendet und die Charakterisierung von Lipidnanopartikeln (LNP) wurde mit Zetasizer Nano ZS, BO LSRFortessa und der Software BO FACSDiva v8.0.3 durchgeführt. Für die Immunfluoreszenztests (IF) wurden Bilder mit dem 30 Histec Panoramic 250-Scanner aufgenommen. Für NanoString wurden die Proben mit dem digitalen Analysegerät nCounter analysiert. Die OC-Lipidkonzentration wurde mittels LC-MS-Analyse bestimmt. Für den chromatographischen Schritt wurde ein Waters Zevo TQs-System verwendet, das mit einem MRM-Detektor ausgestattet war.

Microsoft Excel (Office 365), Graphpad Prism v9, FlowJo vl0.7.1 und 30 Histec Caseviewer 2.4 (CaseViewer – 3DHISTECH Ltd.) wurden zur Analyse von FISH-Objektträgern verwendet. QuPath wurde zur Evaluierung von DLL3 IHC verwendet. Die Datenerfassung erfolgte mit dem nCounter Digital Analyzer (NanoString Technologies).

Zelllinien NCI-H466 (HTB-171), NCI-H82 (HTB-175), NCI-H1299 (CRL-5803), SK-MEL-28 (HTB-72), CT26 (RL-2638), 4T1 (CRL -2539) und N1E-115 (CRL-2263) wurden alle von ATCC (Gaithersburg, MD) gekauft. CT-2A-luc (SCC195) und MCC14/2 (10092303) wurden von Millipore Sigma (Burlington, MA) gekauft. Die murine Kolonadenokarzinom-Zelllinie MC38 wurde freundlicherweise von Prof. Joseph Glorioso von der University of Pittsburgh gespendet. NCI-H446-, NCI-H82-, NCI-H1299-, SK-MEL-28-, MCC14/2-, CT26- und 4T1-Zellkulturen wurden alle in RPMI-1640-Medium (Gibco, Gaithersburg, MD), ergänzt mit 10 % hitzeinaktiviertem Medium, gehalten FBS (Gibco, Gaithersburg, MD) und 1 % Penicillin/Streptomycin (Gibco, Gaithersburg, MD). MC38-, CT-2A-luc- und N1E-115-Zellen wurden in DMEM-Medium (Gibco, Gaithersburg, MD), ergänzt mit 10 % hitzeinaktiviertem FBS und 1 % Penicillin/Streptomycin, kultiviert. Alle Zellkulturen wurden in einer feuchten Atmosphäre mit 5 % CO2 bei 37 °C inkubiert.

Picornaviral-Positivstrangsequenzen wurden von NCBI (SVV-00145 (GenBank: DQ641257) und CVA2146 (Genbank: AF546702.1) erhalten. Für die 5′ der viralen Matrize und 30 Nukleotide lange Polyadenosin (pA)-Sequenzen wurden maßgeschneiderte Ribozyme entworfen wurden am 3'-Ende hinzugefügt, gefolgt von der Restriktionsstelle SapI (SVV) oder BsmBI (CVA21), um nach der Linearisierung Polythymidin-Templates der entsprechenden Länge zu erzeugen. Die SVV-S177A-Mutation wurde durch Punktmutagenese für das verwendete SVV-S177A-Virus eingeführt in der ergänzenden Abbildung 8, und das synthetische SVV-Virus SVV(S177A-IRES2) besteht aus SVV-001 einschließlich dieser Mutation und einem verbesserten IRES, SVV IRES2. Diese Sequenz stammt von SVA/Canada/MB/NCFAD-104-1 /2015 (GenBank: KY486156). Die IVT-Vorlagen wurden mit synthetischen dsDNA-Fragmenten (IDT Geneblocks, Genscript, Piscataway, NJ) und Gibson-Assembly (NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix, Katalog-Nr. E2621L, NEB, Ipswich, MA) nach dem konstruiert Herstellerprotokoll. Diese Konstrukte wurden End-to-End sequenziert, entweder mit SapI (SVV) oder BsmBI (CVA21) (NEB SapI # R0569L, BsmBI # R0739L, Ipswich, MA) und IVTs in Forschungsqualität (NEB HiScribe T7 High Yield RNA) linearisiert Synthese-Kit-Katalog Nr. E2040S, Ipswich, MA) wurden durchgeführt, um den viralen Kickoff sicherzustellen. Alle in dieser Arbeit verwendeten Virusbestände wurden mit diesen Reverse-Genetik-Systemen gewonnen.

IVTs im großen Maßstab (20–100 mg) wurden bei Aldevron (Fargo, ND) durchgeführt und durch Diafiltration gereinigt. In einigen Fällen wurden IVTs (1–50 ml) intern unter Verwendung eines Heizblocks (Eppendorf Thermomixer, Hamburg, Deutschland) bei 37 °C für 2,5 Stunden unter Verwendung eines Puffers durchgeführt, der Magnesiumacetat, Tris-HCl (EMD-Millipore, Danvers, MA), TCEP (EMD Millipore Danvers, MA), äquimolare NTPs (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA), anorganische Pyrophosphatase (NEB Ipswich, MA) und T7 RNAP (NEB, Ipswich, MA). DNase I (NEB, Ipswich, MA) wurde am Ende der IVT für 30 Minuten hinzugefügt und mit EDTA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) gequencht. Als nächstes wurde eine Tangentialflussfiltration (TFF) unter Verwendung einer 100 kDa mPES-Membran (Repligen, Marlborough, MA) durchgeführt und mit Wasser diafiltriert. Das TFF-Retentat wurde anschließend mit Salz eingestellt und auf eine Oligo-dT-Chromatographiesäule (BIA Separations, Ajdovščina, Slowenien) geladen. RNA, die einen pA-Schwanz enthielt, wurde mit Wasser eluiert. Ein abschließender TFF-Schritt wurde als Entsalzungsschritt durchgeführt, um sicherzustellen, dass die gewünschte RNA-Konzentration (1,0 mg/ml) und der gewünschte pH-Wert (6,5) erreicht wurden. Diese RNAs waren die Grundlage für die LNP-Erzeugung.

LNPs wurden hergestellt, indem geeignete Volumina an Lipiden in Ethanol mit einer vRNA-haltigen wässrigen Phase unter Verwendung eines Mikrofluidikgeräts NanoAssemblr (Precision NanoSystems) gemischt und anschließend weiterverarbeitet wurden. Unter Verwendung eines Flussverhältnisses von 3:1 wässriger:organischer Phase wurden die Lösungen mit einem Mikrofluidik-Chip und einer Gesamtflussrate von 12 ml/min kombiniert. LNPs wurden gegen einen neutralen pH-Puffer wie 1 × PBS dialysiert, um Ethanol zu entfernen und den pH-Wert zu erhöhen. Die resultierenden LNPs wurden unter Verwendung von Amicon Ultra-Zentrifugalfiltereinheiten mit einer Molekulargewichtsgrenze von 100.000 Da (Millipore, Burlington, MA) konzentriert. Die RNA-Einkapselung wurde mit Quant-iT RiboGreen (Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA) und einem Mikroplattenlesegerät (SpectraMax, San Jose, CA) untersucht. Die hydrodynamische Größe und der PDI der LNPs wurden durch dynamische Lichtstreuung unter Verwendung eines Zetasizer Nano ZS (Malvern Panalytical, Malvern, Vereinigtes Königreich) analysiert.

Die Produktion von Virusstamm erfolgte durch vRNA-Transfektion unter Verwendung von Lipofectamine RNAiMax® (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Transfektionsreagenz (1 μg/ml) wurde zu NCI-H1299-Zellen gegeben, die in einer Gewebekulturplatte mit 12 Vertiefungen ausgesät wurden, bei 1 × 105 Zellen/Vertiefung. 72 Stunden nach der Transfektion wurden die Überstände gesammelt, 5 Minuten bei 2000 × g zentrifugiert und durch einen 0,45 μm-Filter filtriert. Gefilterter Überstand (100 μl) wurde verwendet, um eine neue Platte mit 12 Vertiefungen zu infizieren, die mit NCI-H1299-Zellen besiedelt war. Nach 72 Stunden wurden die Zellen und Überstände 3x Einfrier-Auftau-Zyklen unterzogen, dann zentrifugiert und filtriert. Der Überstand (1 ml) wurde dann verwendet, um NCI-H1299-Zellen zu infizieren, die in einem CellSTACK®-Gewebekulturgefäß mit zwei Kammern (Corning, Corning, NY) in 250 ml Wachstumsmedium bis zu einer Konfluenz von 80 % gezüchtet wurden. 96 Stunden nach der Infektion wurden die Zellen und Überstände dreimal eingefroren, aufgetaut, zentrifugiert, filtriert und unter Verwendung von 100 K Amicon® Ultra 15-Zentrifugalfiltereinheiten (Millipore, Burlington, MA) auf ein Endvolumen von 10 ml konzentriert, das aliquotiert wurde und bei −80 °C gelagert.

Um die SVV-Infektiosität durch IC50 zu quantifizieren, wurden NCI-H446-Zellen in 96-Well-Gewebekulturplatten mit 1 × 104 Zellen/Well ausgesät und bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Nach 48 Stunden wurde das Kulturmedium abgesaugt und durch 10-fache Reihenverdünnungen von infektiösem SVV in einem Volumen von 100 µL ersetzt. Nach 48 Stunden wurde die Zelllebensfähigkeit infizierter oder scheinbehandelter Zellen mit dem CellTiter-Glo®-Lumineszenztest (Promega, Madison, WI) unter Verwendung eines Mikroplattenlesegeräts (Molecular Devices, SpectraMax i3X Minimax Imaging Cytometer, San Jose, CA) gemessen. Die Rohdaten wurden in prozentuale Überlebensraten im Vergleich zu Scheininfizierten umgerechnet. Die Werte wurden in der GraphPad-Software Prism 9.0 grafisch dargestellt und mithilfe eines nichtlinearen Sigmoiddiagramms mit variabler Steigung (asymmetrische lineare Vierpunktregression) analysiert, um IC50-Werte zu generieren. Für jede Probe wurden mindestens fünf technische Wiederholungen analysiert, um den IC50 zu berechnen.

Um den SVV-Titer mittels Plaque-Assay zu quantifizieren, wurden 2 × 105 MCC14/2-Zellen/Vertiefung in Gewebekulturplatten mit 12 Vertiefungen ausgesät. Nach 24 Stunden wurde das infektiöse Virus 10-fach seriell in serumfreiem Medium verdünnt. Das Kulturmedium aus den Zellen wurde abgesaugt und durch 300 µL/Vertiefung verdünnten Virus für einen Adsorptionszeitraum von 1 Stunde bei 37 °C unter leichtem Schütteln ersetzt. Virusproben wurden in technischer Dreifachausfertigung analysiert. Nach der Adsorption wurden jeder Vertiefung 2 ml vorgewärmte 1 %ige Methylzellulose in Medium mit 5 % FBS zugesetzt. Nach 48 Stunden wurden die Vertiefungen abgesaugt und mit Kristallviolettlösung angefärbt. Einzelne Plaque-bildende Kolonien wurden manuell gezählt, um den Titer zu bestimmen.

Zur Quantifizierung des CVA21-Virus mittels Plaque-Assay wurden 2 × 105 SK-MEL28-Zellen/Vertiefung in eine Platte mit 24 Vertiefungen (oder 2,5 × 105 NCI-H1299-Zellen/Vertiefung in eine Platte mit 12 Vertiefungen) ausgesät. Mausgewebehomogenate wurden durch Resuspendieren pulverisierter gefrorener Gewebeproben in 2 μl PBS/mg Tumor hergestellt. Nach dem Mischen wurden die Proben pelletiert und die Überstände wurden gewonnen. Ganze Gewebehomogenate wurden 10-fach seriell in serumfreiem Medium verdünnt. Nachdem das Medium entfernt worden war, wurden 250 μl der Verdünnungen in jede Vertiefung gegeben. Die Platte wurde 1 Stunde lang vorsichtig bei 37 °C geschüttelt. Dann wurde 1 ml vorgewärmtes 1 % Methylcellulose in 5 % FBS enthaltendem Medium als Überzug hinzugefügt. Die Platten wurden 48 Stunden lang inkubiert, bevor 250 μl Kristallviolettfarbstoff in jede Vertiefung gegeben wurden. Anschließend wurde die Auflage entfernt und 30 Minuten lang bei Raumtemperatur geschüttelt. Die Platten wurden gewaschen und trocknen gelassen, um Plaques sichtbar zu machen.

Bei Maine Biotechnology Services (Portland, ME) wurden polyklonale Kaninchen-SVV-Antiseren gegen UV-inaktiviertes SVV erzeugt. Um den Neutralisationstiter zu messen, wurden NCI-H446-Zellen in 96-Well-Gewebekulturplatten mit 1 × 104 Zellen/Well in Komplettmedium ausgesät und bei 37 °C, 5 % CO2 inkubiert. Nach 48 Stunden wurde 1 × 107 TCID50/ml SVV mit in Vollmedium verdünnten Kaninchen-Anti-SVV-Seren gemischt. Es wurden serielle Zweifachverdünnungen der Seren von 1:20 bis 1:5120 getestet. Das Kulturmedium wurde von den Zellen abgesaugt und durch 100 µl verdünntes SVV pro Vertiefung ersetzt. Die Zellen wurden wieder bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert und 48 Stunden nach der Infektion wurden In-vitro-Lebensfähigkeitstests durch Zugabe von 100 µL/Well CellTiter-Glo® 2.0-Reagenz (Promega, Madison, WI) durchgeführt. Die Gesamtlumineszenz (RLU) wurde mit einem Plattenlesegerät (Molecular Devices, SpectraMax i3X Minimax Imaging Cytometer, San Jose, CA) gemessen. Rohdaten wurden in prozentuale Überlebensraten im Vergleich zu Scheininfizierten umgewandelt und die Werte wurden in GraphPad Software Prism 9.0 grafisch dargestellt.

NCI-H82-Zellen wurden durch Ablösen mit Trypsin-EDTA (ThermoFisher, Waltham, Massachusetts) geerntet, durch Zentrifugation gewaschen und in eiskalter Phosphatpuffersalzlösung (PBS) mit 5 % Rinderserumalbumin (BSA) resuspendiert. Eine Million Zellen pro ml wurden mit 10 µg/ml DLL3-spezifischem Phycoerythrin-konjugiertem Antikörper (Kat.-Nr. 154003) oder Isotypkontrolle (Kat.-Nr. 400607) inkubiert. Beide Antikörper wurden von BioLegend (San Diego, USA) gekauft und die Daten wurden auf einem BD LSRFortessa mit der BD FACSDiva-Software erfasst und mit der FlowJo-Software analysiert.

In-vivo-Experimente in den Xenotransplantat-Tumormodellen NCI-H466, NCI-H82, NCI-H1299 und SK-MEL-28 wurden an 8–12 Wochen alten weiblichen NU/NU-Nacktmäusen durchgeführt (Charles River Laboratories, Wilmington, MA). . Das N1E-115-Maus-Neuroblastom-Tumormodell wurde in 8–12 Wochen alten weiblichen A/J-Mäusen etabliert (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME). Für Studien in 4T1- und CT26-Tumormodellen wurden 8–12 Wochen alte weibliche BALB/c-Mäuse (Charles River Laboratories) verwendet. Studien mit dem MC38- und CT-2A-luc-Tumormodell wurden an 8–12 Wochen alten weiblichen C57BL/6-Mäusen (Charles River Laboratories) durchgeführt. Gemäß den IACUC-Vorschriften wurden Mäuse mit subkutanen Tumoren auf humane Weise eingeschläfert, sobald das Tumorvolumen 2000 mm3 erreichte. In einigen Fällen wurde dieser Grenzwert am letzten Messtag überschritten und die Mäuse wurden sofort eingeschläfert. Mit Ausnahme dieser Fälle kam es zu keinen Abweichungen vom genehmigten Protokoll und das maximale Tumorvolumen wurde nicht überschritten. Alle Tiere hatten uneingeschränkten Zugang zu sterilem, pelletiertem Nagetierfutter und durch Umkehrosmose gereinigtem Wasser und wurden in einem 12:12-Stunden-Licht-Dunkel-Zyklus mit Zugang zur Umweltanreicherung gehalten. Alle Tierprotokolle für Mäuse und nichtmenschliche Primaten wurden vom Oncorus Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt und gemäß den IACUC-Vorschriften durchgeführt.

Um subkutane Xenotransplantat-Tumormodelle zu etablieren, wurden 5 × 106–1 × 107 lebensfähige Tumorzellen in 100 µl einer Mischung aus Matrigel (Corning, Glendale, AZ):PBS (Gibco, Gaithersburg) (1:1) in die rechte Flanke von Nacktmäusen injiziert v/v). Für das subkutane syngene N1E-115-Tumormodell wurden lebensfähige 5 × 105 N1E-115-Zellen in 100 µl Matrigel in PBS-Mischung (1:1 v/v) in die rechte Flanke von A/J-Mäusen injiziert. Die Behandlung wurde eingeleitet, als die Tumoren das vorgegebene Volumen von 150 ± 30 mm3 für menschliche Xenotransplantatmodelle und 100 ± 25 mm3 für syngene Tumormodelle erreichten. Die Tiere wurden anhand des Tumorvolumens paarweise zugeordnet und nach dem Zufallsprinzip den Behandlungsarmen zugeordnet. Synthetische RNA-Viren wurden intravenös in Dosen im Bereich von 0,025 bis 3,0 mg/kg in wöchentlichen Abständen für eine Gesamtzahl von bis zu 4 Dosen verabreicht, wie in den Legenden zu den Abbildungen erläutert.

Anti-Maus-PD-1-Antikörper (Klon RMP1-14, Kat.-Nr. BE-0146, BioXCell, Lebanon, NH) oder Ratten-IgG2a-Isotypkontrolle (Klon 2A3, Kat.-Nr. BE0089, BioXCell, Lebanon, NH) wurden intraperitoneal dosiert ( IP) in einer Dosis von 200 µg/Maus, dreimal alle 3 Tage verabreicht.

Für das orthotope SCLC-Tumormodell wurden lebensfähige 5 × 106 NCI-H82-Zellen, suspendiert in einer Matrigel:PBS-Mischung (1:1 v/v), durch intrathorakale Injektion in den linken Lungenlappen implantiert. Die Behandlung begann 2 Wochen nach der orthotopen Zellinokulation und bestand aus zwei 1,0 mg/kg IV-Dosen von Synthetic-SVV-Neg oder Synthetic-SVV, die im Abstand von 7 Tagen verabreicht wurden. Für die Überlebensanalyse wurden die Mäuse hinsichtlich vorher festgelegter Überlebensendpunkte beobachtet, die im Fall von orthotopen Lungentumoren aus Symptomen einer Lungenerkrankung und einem verschlechterten Körperzustand (d. h. einem Körpergewichtsverlust von mehr als 20 %) bestanden.

Für das subkutane MC38-Tumormodell wurden lebensfähige 5 × 105 MC38-Zellen in 100 µl PBS in die rechte Flanke von C57BL/6-Mäusen injiziert. Modelle für Brustkrebs (4T1) und Dickdarmkrebs (CT26) bei Mäusen wurden in BALB/c-Mäusen durch subkutane Injektion von 1 × 106 Zellen in 100 µl PBS in die rechte Flanke der Tiere etabliert. Als die Tumoren 250 mm3 erreichten, wurden die Mäuse auf humane Weise eingeschläfert, die Tumoren wurden gesammelt, enzymatisch dissoziiert und immunphänotypisiert, wie unten beschrieben. Für orthotope CT-2A-luc-Maus-Gliomtumoren wurden in 11–12 Wochen alten weiblichen C57BL/6-Mäusen durch intrazerebrale Injektion von 5 × 104 CT-2A-luc-Zellen, suspendiert in 2 µl PBS, etabliert. Man ließ die Tumore 14 Tage lang wachsen; Anschließend wurden die Mäuse auf humane Weise eingeschläfert, die Tumoren gesammelt, enzymatisch dissoziiert und immunphänotypisiert, wie unten beschrieben.

Nacktmäuse mit subkutanen NCI-H446-Tumoren wurden durch intraperitoneale Injektion von 1,5 mg Kaninchen-SVV-Antiserum passiv gegen SVV immunisiert. Kontrolltiere erhielten eine entsprechende Menge normales Kaninchenserum (Normal Rabbit Serum, ImmunoReagents, Inc., Raleigh, NC). Der Immunisierungszyklus wurde zweimal im Abstand von 7 Tagen wiederholt. 24 Stunden nach jedem adoptiven Serumtransfer wurden Kontrollmäuse und passiv immunisierte Mäuse intravenös entweder mit 106 PFU SVV-Virionen oder 0,1 mg/kg synthetischem SVV behandelt. Gemäß den IACUC-Vorschriften wurden Mäuse auf humane Weise eingeschläfert, sobald das Tumorvolumen 2000 mm3 erreichte. In einigen Fällen wurde dieser Grenzwert am letzten Messtag überschritten und die Mäuse wurden sofort eingeschläfert. Mit Ausnahme dieser Fälle kam es zu keinen Abweichungen vom genehmigten Protokoll und das maximale Tumorvolumen wurde nicht überschritten.

Um das SCLC-PDX-Modell zu etablieren, wurden 2 × 2 mm große Fragmente von LU5184-SCLC-Tumoren (Crown Bioscience, San Diego) mit einem sterilen Trokar in 6–8 Wochen alte weibliche NOD-SCID-Mäuse (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) implantiert ). Die Behandlung begann, sobald die Tumoren ein vorgegebenes Volumen von etwa 150 mm3 ± 50 mm3 erreichten. Die Tiere wurden anhand des Tumorvolumens paarweise zugeordnet und nach dem Zufallsprinzip den Behandlungsgruppen zugeordnet. Synthetic-SVV und Synthetic-SVV-Neg wurden in zwei wöchentlich verabreichten intravenösen Dosen von 1,0 mg/kg verabreicht. Die behandelten Tiere wurden täglich auf klinische Manifestationen unerwünschter Ereignisse beobachtet, das Körpergewicht und das Tumorvolumen wurden alle zwei Wochen aufgezeichnet. Wie vom IACUC von Crown Bioscience genehmigt, wurden Mäuse auf humane Weise eingeschläfert, sobald die Tumorlast 3000 mm3 erreichte. Es traten keine Abweichungen vom genehmigten Protokoll auf und das maximale Tumorvolumen wurde nicht überschritten.

Für die pharmakodynamische Analyse der Virusreplikation in SCLC-PDX-Tumoren wurden tumortragende Mäuse mit einer einzelnen intravenösen Dosis von 1 mg/kg Synthetic-SVV oder Synthetic-SVV-Neg behandelt. Fünf Tage nach der Behandlung wurden Tumore gesammelt und verarbeitet, um die Negativstrang-SVV-RNA mittels RT-qPCR zu bewerten. Eine andere Gruppe von Mäusen wurde an den Tagen 1 und 3 mit zwei intratumoralen Dosen von 106 PFU SVV-Virionen behandelt. Zwei Tage nach der zweiten Behandlung wurden Tumore gesammelt und verarbeitet, um Negativstrang-SVV-RNA mittels RT-qPCR zu bewerten.

Das SCLC GEMM-Modell wurde wie zuvor beschrieben33 im Preclinical Modeling, Imaging & Testing Core (PMIT) am Koch-Institut etabliert. Kurz gesagt handelte es sich um 8 Wochen alte RPM-Mäuse (Rb1fl/fl Trp53 fl/fl fl/fl Myc LSL/LSL (RPM)-Mäuse, die ein Cre-Rekombinase-regulierbares MycT58A-Allel unter der Kontrolle eines CAG-Promotors enthielten, The Jackson Laboratory Bar Harbor, ME). anästhesiert und mit 106–108 PFU Ad5-Cgrp-Cre-Viren (Universität Iowa) durch intratracheale Instillation infiziert, wie an anderer Stelle beschrieben47. Gemäß den Richtlinien des Institutional Biosafety Committee wurden Viren in einem Raum der Biosicherheitsstufe 2+ verabreicht. Männliche und weibliche Mäuse wurden bei allen Experimenten gleichmäßig auf die Behandlungsgruppen aufgeteilt. Die Entwicklung orthotopischer SCLC-Tumoren wurde mittels MicroCT überwacht. Tumoren wurden gesammelt und eine Primärkultur wurde angelegt und in DME-Medium (Gibco, Gaithersburg, MD), ergänzt mit 10 % hitzeinaktiviertem FBS (Gibco, Gaithersburg, MD) und 1 % Penicillin/Streptomycin (Gibco, Gaithersburg, MD) gehalten. . Um subkutane Tumormodelle zu etablieren, wurden 5 × 106 lebensfähige Tumorprimärzellen in 100 µl einer Mischung aus Matrigel (Corning, Glendale, AZ):DME (Gibco, Gaithersburg) (1:1 v/v) in die rechte Flanke von Nacktmäusen injiziert. in die rechte Flanke von RPM-Mäusen. Die Behandlung wurde eingeleitet, als die Tumoren das vorgegebene Volumen von 100 ± 30 mm3 erreichten. Synthetic-SVV und Synthetic-SVV-Neg wurden in zwei wöchentlich verabreichten intravenösen Dosen von 1,0 mg/kg verabreicht. Die behandelten Tiere wurden täglich auf klinische Manifestationen unerwünschter Ereignisse beobachtet, das Körpergewicht und das Tumorvolumen wurden alle zwei Wochen aufgezeichnet. Gemäß den IACUC-Vorschriften wurden Mäuse auf humane Weise eingeschläfert, sobald die Tumorlast 2000 mm3 erreichte. Es traten keine Abweichungen vom genehmigten Protokoll auf und das maximale Tumorvolumen wurde nicht überschritten.

Für die pharmakodynamische Analyse der Virusreplikation in SCLC-GEMM-Tumoren wurden tumortragende Mäuse mit 2 IV-Dosen von 1 mg/kg synthetischem SVV oder PBS behandelt. Fünf Tage nach der Behandlung wurden Tumore gesammelt und verarbeitet, um negative und positive SVV-RNA-Stränge durch RT-qPCR und Transkriptionsprofilierung unter Verwendung des NanoString Mouse PanCancer IO 360 Gene Expression Panel (Supplementary Data 1, die Rohdaten pro Tier/Probe) zu bewerten Basis- und IO360-Scores sind enthalten).

Die Verträglichkeit wurde bei SVV-permissiven A/J-Mäusen beurteilt, die wie oben beschrieben subkutane N1E-115-Tumoren trugen. Den Tieren wurde eine intravenöse Dosis von 3 mg/kg synthetisches SVV verabreicht und sie wurden täglich auf klinische Symptome beobachtet. Das Körpergewicht wurde nach jeder Behandlung mindestens an drei aufeinanderfolgenden Tagen erhoben. Die Immunantworten wurden 6 und 24 Stunden nach der IV-Behandlung analysiert, während die klinische Pathologie am Ende der Studie bewertet wurde. Für die Bioverteilungsanalyse wurden Gewebe (Milz, Leber, Herz, Lunge, Niere, Muskel, Tumor) nach 30 Minuten, 24 Stunden und 7 Tagen gesammelt und mittels LC-MS analysiert. Die Virusreplikation wurde bei naiven A/J-Mäusen nach einer einzelnen IV-Behandlung mit 3 mg/kg synthetischem SVV beurteilt. Gewebe (Milz, Leber, Herz, Lunge, Niere) wurden nach 24 Stunden und 7 Tagen gesammelt und mittels Plaque-Titer-Assay analysiert.

Die Verträglichkeit wurde bei CVA21-permissiven transgenen huICAM1-Mäusen nach einer IV-Dosis von 1,6 mg/kg Synthetic-CVA21 beurteilt. Die Tiere wurden täglich auf klinische Symptome unerwünschter Ereignisse beobachtet und an fünf aufeinanderfolgenden Tagen nach der Behandlung gewogen. Gewebepathologie und CVA21-Replikation bei behandelten Tieren wurden 2 und 7 Tage nach der Behandlung bewertet.

In der Literatur ist gut belegt, dass sich die Pharmakokinetik der Verträglichkeit, die Immunantwort, die Bioverteilung und die Verträglichkeit in Bezug auf Lipid-Nanopartikel zwischen Mäusen und NHP stark unterscheiden48. Die Verträglichkeit bei NHP wurde anhand von 3–7 Jahre alten naiven männlichen Javaneraffen mauritischen Ursprungs (Envigo, Indianapolis, IN) beurteilt. Die Tiere wurden in einer Umgebung mit kontrollierter Temperatur und Luftfeuchtigkeit gehalten (18–30 °C bzw. 30–70 %). Der automatisch gesteuerte 12-Stunden-Dunkel-/Hell-Zyklus wurde beibehalten, außer zu Zeiten, zu denen geplante Eingriffe durchgeführt wurden. Alle Tiere hatten uneingeschränkten Zugang zu Wasser, wurden mit NHP-Labordiät 250 gefüttert und hatten Zugang zu Umweltanreicherungen, wie in den Standardarbeitsanweisungen beschrieben.

Synthetisches SVV wurde in einer Dosis von 1 mg/kg als 60-minütige intravenöse Infusion über die periphere Vene (Kopfvene oder Saphena) an vorübergehend eingeschränkte, nicht sedierte Tiere verabreicht. Die Behandlung wurde in zweiwöchentlichen Abständen mit insgesamt 3 Dosen wiederholt. Der erste Tag der Dosierung wurde als Tag 1 bezeichnet. Für die PK-Analyse wurden Blutproben am Ende der Infusion (EOI), 5 Minuten, 0,5, 2, 8, 12, 24 und 48 Stunden, entnommen. Die Plasmakonzentration ionisierbarer Lipide (OC) wurde mittels LC-MS bestimmt. Die nicht-kompartimentelle pharmakokinetische Bewertung wurde mit der Phoenix WinNonlin-Software Version 8.3 (Certara, Princeton, NJ) durchgeführt. Für die klinische Pathologieanalyse wurden Blutproben vor der Dosis sowie 2, 6 und 24 Stunden nach jeder Behandlung entnommen. Hämatologie, klinische Chemie, Zytokin und Plasmaspiegel der Komplement-C5b9-Komponente wurden bewertet. Gewebeproben (Großhirn, Mittelhirn, Kleinhirn, Medulla/Pons, Lendenwirbelsäule, Rückenmark, Herz, Leber, Niere, Lunge, Milz, mesenterialer Lymphknoten, Skelettmuskel) für die Bioverteilungsanalyse wurden 24 Stunden nach der 3. IV-Behandlung entnommen, schockgefroren und verarbeitet mittels RT-qPCR-Analyse auf das Vorhandensein von Positivstrang-SVV-RNA untersucht.

Die klinische Chemie wurde entweder mit dem Randox Imola-Analysegerät (Randox, Kearneysville, WV) oder mit der hämatologischen Analyse mit dem automatischen Analysegerät Siemens Advia 120 (Siemens Healthcare GmbH, Erlangen, Deutschland) analysiert.

Die Analyse der Plasmaspiegel proinflammatorischer Zytokine wurde mittels NHP und mausspezifischem Multiplex-Assay (K15056D bzw. K15048D; Meso Scale Diagnostics, Rockville, MD) durchgeführt. Darüber hinaus wurden MCP-1 und TNFα von Cynomolgus-Affen mit Einzelanalyt-Assay-Kits (K156UCK bzw. K156NND; Meso Scale Diagnostics) analysiert. In ähnlicher Weise wurde Maus-MCP-1 mit einem Single-Plex-Assay-Kit (K152NN, Meso Scale Diagnostics) analysiert.

Die Spiegel der Maus-C3-Komplementkomponenten wurden mit dem Maus-Komplement-C3-ELISA-Kit (ab157711, Abcam, Waltham, MA) analysiert. Die C5b9-Spiegel im Plasma von Cynomolgus-Affen wurden mit dem Human C5b9 ELISA Kit (558315, BD, Franklin Lakes, NJ) analysiert.

Die Proben wurden während des gesamten Verfahrens vor der RNA-Extraktion unter Verwendung von Trockeneis und flüssigem Stickstoff zum Schockgefrieren gefroren gehalten. Die Proben wurden mit dem automatisierten Trockenpulverisierer Cp02 cryoPREP (Covaris, 500001, Covaris, Woburn, MA) für SVV- und CVA21-behandelte Tumorproben pulverisiert. Für SVV-Proben wurden 10 mg pulverisierte Probe abgewogen und in ein 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen (Probenröhrchen RB, QIAGEN 990381, Hilden, Deutschland) überführt. Puffer RLT Plus mit B-Mercaptoethanol (600 µL) wurde zu jeder Probe hinzugefügt und lysiert. Die restlichen Schritte wurden mit dem QIAcube (QIAGEN, Hilden, Deutschland) gemäß dem Herstellerprotokoll für das QIAGEN RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN 74134) im Abschnitt „Reinigung von Gesamt-RNA aus tierischen Geweben“ durchgeführt. RNA-Proben wurden nach der Extraktion mit DNAseI (RNAse-frei) (New England Biolabs, #M0303S, Ipswich, MA) behandelt.

Für CVA21-Proben wurden 10 mg pulverisierte Probe abgewogen und in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführt. Zu jeder Probe wurde ein Lysepuffer/Proteinase-K-Gemisch (400 µl) (RNAdvance Tissue Kit, Beckman Coulter, A32649, Pasadena, CA) hinzugefügt. Die Proben wurden mindestens 30 Minuten lang bei 37 °C inkubiert, um die Proben vollständig zu lysieren. Die restlichen Schritte wurden mit dem Biomek i5 (Beckman Coulter, B87583, Pasadena, CA) gemäß dem Protokoll des Herstellers (RNAdvance Tissue Kit) durchgeführt. Das RNAdvance Tissue Kit beinhaltet einen DNase I-Behandlungsschritt.

RNA-Proben wurden auf einen gleichen Input für die cDNA-Synthese normalisiert. Für die Synthese von cDNA wurden Virus-Negativstrang-spezifische Primer verwendet. Der SVV-Negativstrang-spezifische Primer 5′-GCGCAAATTCGTCCAAAACAACGAC-3′, der SVV-Positivstrang-spezifische Primer 5′ ACATAGAAACAGATTGCAGCTTCTC -3′ und der CVA21-Negativstrang-spezifische Primer 5′-AGACTACGGACTGACCATGACTC TTAGGACGCTTTTACTGAGAAC -3′ wurden von Integrated DNA Technologies synthetisiert (IDT, Coralville, Iowa). Sowohl für SVV als auch für CVA21 wurde die cDNA-Synthese unter Verwendung des SuperScript IV First-Strand Synthesis System (Invitrogen, 18091200, Carlsbad, CA) und ihrer jeweiligen spezifischen Primer durchgeführt.

Die quantitative PCR-Analyse (qPCR) wurde mithilfe der TaqMan-Sondenchemie durchgeführt. Es wurden qPCR-Reaktionen (20 µL) durchgeführt, die 10 µL TaqMan Fast Advanced Master Mix (Applied Biosystems, 4444557, Foster City, CA), 1 µL TaqMan Gene Expression Assay, FAM-Sonde (Applied Biosystems, 4332078) und 4 µL Nuklease enthielten -freies Wasser und 5 µL verdünnte cDNA. Die TaqMan-Genexpressionsassay-Sonden wurden speziell für SVV oder CVA21 hergestellt. SVV-Sonde 5′-TGGAAGCCATGCTCTCCTACTTCA-3′, Vorwärtsprimer 5′-CGACGGCTTATACAAACCAGTTA-3′, Rückwärtsprimer 5′-AGCTTCTCGAGTAGTGTTCCT-3′ und CVA21-Sonde 5′-TGCCTATGGTGATGACGTGATAGCT-3′, Vorwärtsprimer 5′-GAGAACCTACAAGGGCATAGAC-3′, und der Reverse-Primer 5′-TAGGAGACTAGCGTCAACCT-3′ wurden kundenspezifisch bei Applied Biosystems (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) bestellt. qPCR-Parameter 95 °C für 20 s, gefolgt von 40 Zyklen bei 95 °C für 1 s und 60 °C für 30 s. Jeder qPCR-Assay enthielt technische Dreifachkopien für jeden Standard und jede Probe.

Die Tumoren wurden zu den angegebenen Zeitpunkten geerntet, halbiert, 24 Stunden lang bei Raumtemperatur in 10 % gepuffertem Formalin fixiert und in Paraffin eingebettet. RNAscope FISH von SVV-negativen und positiven RNA-Strängen wurde bei Advanced Cell Diagnostics (ACD, Newark, CA) durchgeführt. Es wurden standardmäßige RNAscope LS Multiplex-Fluoreszenz-Vorbehandlungsbedingungen verwendet. Kurz gesagt, die Epitopgewinnung wurde 15 Minuten lang bei 95 °C durchgeführt, gefolgt von einer 15-minütigen Protease-III-Behandlung bei 40 °C. Die Qualität der Proben wurde zunächst unter Verwendung der positiven und negativen Referenzkontrollen auf Spezifität und Sensitivität beurteilt (ACD-Katalog-Nr. 313908 bzw. 320758). Benutzerdefinierte SVV-Sonden wurden sowohl für den positiven als auch den negativen Strang entwickelt (ACD-Katalog-Nr. 819848 bzw. 819858-C2) und als spezifisch bestätigt. Alle Proben bestanden die Qualitätskontrolle mit positiver Kontrollfärbung und es wurde kaum bis gar keine Hintergrundfärbung beobachtet. RAW-Daten wurden mit der 3DHISTECH CaseViewer Software (3DHISTECH Ltd, Budapest, Ungarn) analysiert.

Die OC-Lipidkonzentration wurde mittels LC-MS-Analyse bestimmt. Eine Standard-Stammlösung mit 100 ng/ml wurde in 1 % Ameisensäure in Methanol hergestellt. Für die Analyse von Plasmaproben wurde die Standardlösung im Plasma auf 200, 180, 120, 40, 20, 5, 1 und 0,5 μg/ml verdünnt, während für die Gewebeanalyse eine Standardkurve bei 80, 72, 48, 16 erstellt wurde. 8, 2, 0,4 und 0,2 mg/ml im Gewebehomogenat. Fünf µl Plasmaprobe wurden mit 120 µl interner Standardkontrolle (IS-C) gemischt, 3 Minuten lang gevortext und 4 Minuten lang bei 12.500 U/min bei 5 °C zentrifugiert. Sechzig µl des resultierenden Überstands wurden mit 140 µl Wasser:Acetonitril-Lösung (3:7 v/v) gemischt und 5 Minuten lang geschüttelt. Ein Aliquot von 0,6 µl des resultierenden Überstands wurde für die LC-MS-Analyse injiziert.

25 µl Gewebehomogenate, die aus in Wasser im Verhältnis 1:1 mμm homogenisierten Gewebeproben gewonnen wurden, wurden mit IS-C gemischt, 3 Minuten lang gevortext und dann mit 140 µl Wasser und Acetonitrillösung (3:7 v/v) gemischt. , und 5 Minuten lang geschüttelt. Ein Aliquot von 0,6 µl des resultierenden Überstands wurde für die LC-MS-Analyse injiziert.

Für die chromatographische Trennung wurde ein Waters Zevo TQs-System verwendet, das mit einem MRM-Detektor ausgestattet war. Die Trennung erfolgte auf einer XB-C8-Säule (50 mm × 2,1 mm, 3,6 μm) mit einem Injektionsvolumen von 0,6 μl. Die mobilen Phasen bestanden aus 0,1 % Ameisensäure in Wasser (A) und 0,1 % Ameisensäure in Acetonitril: Isopropylalkohol (66:34 v/v) (B). Die Proben wurden mit einer Flussrate von 0,5 ml/min und dem folgenden Gradientenprogramm analysiert: 54–100 % B (0–1,51 Min.), 100 % B (1,51–1,8 Min.), 100–54 % B (1,80–1,81 Min.). ) und 54 % B (1,81–2,8 Min.). Die Ionisierung wurde mittels Elektrospray-Ionisation (ESI) im positiven Modus mit MRM-Detektion erreicht.

Die Lungen der behandelten Tiere wurden 10 Tage nach der zweiten synthetischen SVV-Dosis entnommen und 24 Stunden lang in 10 % gepuffertem Formalin fixiert, mit Paraffin verarbeitet und auf der Ebene der Hauptbronchien geschnitten. Für den IHC-Nachweis von DLL3 wurden Schnitte mit Kaninchenantikörpern gefärbt, die spezifisch für menschliches DLL3 sind (0,5 μg/ml, Klon E3J5R, Cell Signaling Technology, Danvers, MA), digital gescannt und einer morphometrischen Analyse mit der QuPath-Software unterzogen.

Schockgefrorene Tumoren (n = 5 Mäuse pro Behandlungsgruppe) wurden pulverisiert und die RNA wurde mit QIAcube (QIAGEN, Hilden, Deutschland) extrahiert, wobei dem Protokoll des Herstellers für das QIAGEN RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN 74134) im Abschnitt „Reinigung von“ gefolgt wurde Gesamt-RNA aus tierischen Geweben. Die gesamte isolierte RNA (60 ng) wurde in einem Endvolumen von 25 µl mit 3'-biotinylierter Einfangsonde und 5'-Reportersonden aus dem Mouse PanCancer IO 360 Gene Expression Panel gemischt. Die Hybridisierung wurde 16 Stunden lang bei 65 °C durchgeführt. Hybridisierte Proben wurden auf der NanoString nCounter-Vorbereitungsstation isoliert, wo die überschüssige Sonde entfernt wurde und hybridisierte Komplexe aus Sonden und Ziel-RNA-Sequenzen auf der Kartusche immobilisiert wurden. Die kartuschengebundenen Proben wurden dann mit dem digitalen Analysegerät nCounter analysiert. Die Datenerfassung erfolgte mit dem nCounter Digital Analyzer (NanoString Technologies) gemäß den Anweisungen des Herstellers, um einzelne fluoreszierende Barcodes zu zählen und die in jeder Probe vorhandenen Ziel-RNA-Moleküle zu quantifizieren. Für jeden Assay wurde ein High-Density-Scan (600 Sichtfelder) durchgeführt. Die Nanostring nCounter™-Genexpressionsanalyse der relativen mRNA-Kopienzahl von 770 Krebs- und Immunsystem-bezogenen Genen wurde auf dem NanoString nCounter™-System (NanoString Technologies) gemäß den Anweisungen des Herstellers quantifiziert. Die Ergebnisse wurden mit der nSolver Analysis Software 4.0 (NanoString) analysiert. Nach der Hintergrundsubtraktion (Entfernung des geometrischen Mittelwerts der Negativkontrollen) wurde jede Probe zunächst auf den geometrischen Mittelwert der Positivkontrollen und dann auf den geometrischen Mittelwert der Referenzgene normalisiert.

Für die Durchflusszytometrie wurden die Tumoren am 14. Tag nach der ersten Dosis gesammelt. Die Tumoren wurden gewogen und dann in kleine Stücke geschnitten, bevor sie mit einem Miltenyi GentleMACs Octo-Dissoziator mit Heizungen gemäß den Anweisungen des Herstellers in Einzelzellsuspensionen zerlegt wurden. AT/NK-Zellen und ein myeloisches Zellfluss-Panel wurden unter Verwendung der folgenden Reagenzien und Ab-Klone durchgeführt: Ein LIVE/DEAD™ Fixable Red Dead Cell Stain Kit für 488-nm-Anregung (Invitrogen, Katalog-Nr. L32102) wurde zur Beurteilung der Lebensfähigkeit verwendet. Die Oberflächenzellfärbung wurde unter Verwendung von BD Stain Buffer (Becton-Dickinson-Katalog-Nr. 554656) mit den Antikörpern für Maus-CD45 (30-F11, Katalog-Nr. 103154), CD3ε (17A2, Katalog-Nr. 100218) und CD8a (53-6.7, Katalog-Nr. 100218) durchgeführt 100730), CD4 (RM4-5, Katalog-Nr. 100552), CD25 (PC61, Katalog-Nr. 102041), CD69 (REA937, Katalog-Nr. 130-115-461), CTLA-4 (UC10-4B9, Katalog-Nr. 106323), NKP46 (29A1.4, Katalog-Nr. 137612), KLRG1 (2F1, Katalog-Nr. 138409), CD127 (A7R34, Katalog-Nr. 135035), PD-1 (29F.1A12, Katalog-Nr. 135216), MHCII (M5/114.15.2, Katalog 107635), Ly6C (H,1.4, Katalog-Nr. 128037), CD206 (C068C2, Katalog-Nr. 141720), CD86 (GL-1, Katalog-Nr. 105037) und PD-L1 (10F.9G2, Katalog-Nr. 124312). Das Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set (eBioscience-Katalog-Nr. 00-5523-00) wurde für die intrazelluläre Färbung von FOXP3 (150D, Katalog-Nr. 320008) und CTLA-4 (UC10-4B9, Katalog-Nr. 106323) verwendet. Alle Antikörper wurden von BioLegend (San Diego, USA) gekauft, mit Ausnahme von CD69 Miltenyi Biotech (Bergisch Gladbach, Deutschland). Die Antikörperverdünnungen waren wie folgt: CD45-APC-Fire750 (1:400), CD3-PerCP-Cy5.5 (1:100), NKp46-BV421 (1:200), CD4-BV785 (1:800), CD8- AF700 (1:400), CD25-BV711 (1:200), Foxp3-PE (1:200), CTLA4-BV605 (1:200), PD1-PE-Cy7 (1:200), CD127-BV510 (1 :100), KLRG1-FITC (1:400), CD11b-BV650 (1:400), MHCII-BV510 (1:200), Ly6C-BV711 (1:200), CD206, PE-Cy7 (1:100) , CD86-BV605 (1:100) und PDL1-APC (1:100). Die Daten wurden auf einem BD LSRFortessa mit der BD FACSDiva-Software erfasst und mit der FlowJo-Software analysiert. Für das T-Zell- und NK-Panel wurden die Zellen zunächst auf Zeit (SSC-A vs. Zeit), Lymphozyten (SSC-A vs. FSC-A) und Singuletts (FSC-H vs. FSC-A) untersucht. Das Lymphozyten-Gate wurde weiter auf die Aufnahme der Lebend-/Tot-Färbung analysiert, um lebende vs. tote Zellen und die CD45-Expression zu bestimmen. Anschließend wurden die Zellen auf CD3 vs. NKP46 gesteuert, um T-Zellen oder NK-Zellen auszuwählen. Bei den T-Zellen wurde die Population auf CD4 vs. CD8 untersucht, und die CD4-T-Zellen wurden zusätzlich auf CD25+ und FOXP3+ untersucht, um die Treg-Population zu analysieren. NK-Zellen wurden auf NKP46+ und CD3− untersucht. Für das Myeloid-Panel wurden die Zellen zunächst nach Zeit (SSC-A vs. Zeit), dann nach Lymphozyten (SSC-A vs. FSC-A) und Singuletts (FSC-H vs. FSCA) untersucht. Das Lymphozyten-Gate wurde weiter auf die Aufnahme der Lebend-/Tot-Färbung analysiert, um lebende vs. tote Zellen und die CD45-Expression zu bestimmen. Dann wurden Makrophagen mit SSC-A vs. CD11b+ und anschließend mit MHCII+Ly6C-Untergruppe gesteuert. Um zwischen M1- und M2-Makrophagen zu unterscheiden, verwendeten wir CD206-CD86+ für M1 und CD206+CD86- für M2. Die Zählung der Zellen pro mg Tumor wurde unter Verwendung von 123Count eBeads (Invitrogen, Katalog-Nr. 01-1234-42, Carlsbad, CA) berechnet. Vor der Analyse mittels Durchflusszytometrie wurde jeder Vertiefung ein festes Volumen an Kügelchen mit einer bekannten Konzentration zugesetzt. Die Anzahl der Perlen in der Gated-Fraktion wurde dann zur Berechnung der Zellzahl unter Verwendung der folgenden Gleichung verwendet:

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Die Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind im Artikel, in den Zusatzinformationen oder in der Quelldatendatei verfügbar. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Diese Studie wurde von Oncorus, Inc. gesponsert. Die Autoren danken Sofie Denies für die statistische Analyse und James B. Rottman (Athenaeum Pathology Consulting) für die morphometrische Analyse. Die Autoren danken außerdem Chastity Bradley, PhD von BioMed Writers, LLC, für ihre redaktionelle Überprüfung und Unterstützung bei der Manuskripteinreichung.

Oncorus, Inc., Cambridge, MA, USA

Edward M. Kennedy, Agnieszka Denslow, Jacqueline Hewett, Lingxin Kong, Ana De Almeida, Jeffrey D. Bryant, Jennifer S. Lee, Judy Jacques, Sonia Feau, Melissa Hayes, Elizabeth L. McMichael, Daniel Wambua, Terry Farkaly, Amal A Rahmeh, Lauren Herschelman, Danielle Douglas, Jacob Spinale, Sanmit Adhikari, Jessica Deterling, Matt Scott, Brian B. Haines, Mitchell H. Finer, Ted T. Ashburn, Christophe Quéva und Lorena Lerner

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Konzeptualisierung: EMK, MF, CQ und LL Methodik: EMK, AD, JH, LK, ADA, JDB, JSL, JJ, SF, MH, ELM, DW, TF, AAR, LH, DD, JS, SA, JD, MS, BBH, CQ und LL Software: EMK, AD, JSL, SF und DW Validierung: EMK, AD, JH, LK, ADA, JDB, JSL, JJ, SF, MH, ELM, DWTF, AAR, LH, DD, JS, SA, JD und MS Formale Analyse: EMK, AD, JDB, JSL, JJ, SF, BBH, CQ, LL Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung: EMK, AD, ADA, JDB, JSL, SF, JD, MS, BBH, CQ und LL Aufsicht: EMK, AD, SF, BBH, CQ und LL Projektverwaltung: EMK, CQ und LL Genehmigung des endgültigen Entwurfs: EMK, AD, JH, LK, ADA, JDB, JSL, JJ, SF, MH, ELM, DWTF, AAR, LF, DD, JS, SA, JD, MS, BBH, TTA, MF, CQ und LL

Korrespondenz mit Edward M. Kennedy.

EMK, AD, JH, LK, ADA, JDB und JSL (zum Zeitpunkt der Durchführung der Studie), JJ, SF (zum Zeitpunkt der Durchführung der Studie), MH, ELM, DW, TF, AAR (zum Zeitpunkt der Durchführung der Studie). (zum Zeitpunkt der Durchführung der Studie), LH (zum Zeitpunkt der Durchführung der Studie), DD (zum Zeitpunkt der Durchführung der Studie), JS (zum Zeitpunkt der Durchführung der Studie), SA (zum Zeitpunkt der Durchführung der Studie), JD, MS (zum Zeitpunkt der Durchführung der Studie), BBH (zum Zeitpunkt der Durchführung der Studie), MF (zum Zeitpunkt der Durchführung der Studie), TTA, CQ, LL (zum Zeitpunkt der Durchführung der Studie) sind Alle Mitarbeiter von Oncorus, Inc. Keine anderen Autoren haben konkurrierende Interessen offenzulegen.

Nature Communications dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Kennedy, EM, Denslow, A., Hewett, J. et al. Entwicklung einer intravenös verabreichten synthetischen RNA-Virus-Immuntherapie zur Behandlung von Krebs. Nat Commun 13, 5907 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-33599-w

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Eingegangen: 11. März 2022

Angenommen: 24. September 2022

Veröffentlicht: 07. Oktober 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-33599-w

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