Erschließung des Potenzials der Cyanobakterien-Photosynthese zur direkten Umwandlung von Kohlendioxid in Glukose

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 3425 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Glukose ist das am häufigsten vorkommende Monosaccharid und dient als wesentliche Energiequelle für Zellen in allen Lebensbereichen und als wichtiger Rohstoff für die Bioraffinerieindustrie. Der Weg Pflanze-Biomasse-Zucker dominiert die derzeitige Glukoseversorgung, während die direkte Umwandlung von Kohlendioxid in Glukose durch Photosynthese nicht gut untersucht ist. Hier zeigen wir, dass das Potenzial von Synechococcus elongatus PCC 7942 für die photosynthetische Glukoseproduktion durch die Unterdrückung der nativen Glukokinaseaktivität freigesetzt werden kann. Das Ausschalten zweier Glukokinase-Gene führt zu einer intrazellulären Anreicherung von Glukose und fördert die Bildung einer spontanen Mutation im Genom, die schließlich zur Glukosesekretion führt. Ohne heterologe Katalyse oder Transportgene führen Glukokinasemangel und spontane genomische Mutation zu einer Glukosesekretion von 1,5 g/L, die durch Stoffwechsel- und Kultivierungstechniken weiter auf 5 g/L erhöht wird. Diese Ergebnisse unterstreichen die Plastizität des Cyanobakterienstoffwechsels und zeigen ihre Anwendungsmöglichkeiten zur Unterstützung der direkten photosynthetischen Produktion von Glukose.

Glukose ist das am häufigsten vorkommende Monosaccharidmolekül in der Natur. Der Abbau von Glukose stellt Energie und Kohlenstoffmaterialien in Zellen in allen Lebensbereichen bereit und treibt die Zellmaschinerie über verschiedene glykolytische Wege an, darunter den Embden-Meyerhof-Parnas-Weg (EMP), den oxidativen Pentosephosphat-Weg (OPP) und den Entner-Weg –Doudoroff (ED)-Weg1,2. Als Monomere sind Glucose und ihre Derivate auch an der Synthese verschiedener Makromoleküle und Zellkomponenten beteiligt3,4. Darüber hinaus dient Glukose auch als wichtiger Rohstoff in der Bioraffinerieindustrie und unterstützt den Anbau mehrerer mikrobieller Zellfabriken für die umweltfreundliche Bioproduktion von Kraftstoffen, Chemikalien und Pharmazeutika5,6,7. In der Natur wird Glukose hauptsächlich durch die Photosynthese von Pflanzen und Algen synthetisiert und liegt als Monomere von Polysacchariden in Pflanzen-/Algenbiomasse vor, z. B. Zellulose und Stärke. Der Weg Pflanze-Biomasse-Zucker dominiert die derzeitige massive Glukoseversorgung, deren wirtschaftliche Machbarkeit von mehreren Parametern beeinflusst wird, wie z. B. Pflanzenanbauzyklen, Biomasse-Sammelradius und Vorbehandlungskosten8,9,10,11.

Vor dem Hintergrund der globalen Klimakrise und der zunehmenden Nahrungsmittelknappheit wäre die Entwicklung effizienterer, kontinuierlicherer und industrieller Glukoseproduktionswege wertvoll12,13. In den letzten Jahren wurde die direkte Umwandlung von Kohlendioxid in Glucose, Glucosevorläufer und Glucosepolymere durch chemisch-biochemische, elektrochemisch-biologische und enzymatische In-vitro-Kaskadenwege erreicht14,15,16. Im Gegensatz dazu konnte die kontinuierliche Glukoseproduktion nicht erfolgreich direkt mit der Photosynthese verknüpft werden. In Photoautotrophen, z. B. höheren Pflanzen und Algen, wird Glukose als Speicher für Kohlenstoff und Energie synthetisiert und spielt wichtige regulatorische Rollen. Der Glukosestoffwechsel weist komplexe Wechselwirkungen mit Photosystemen auf, stört die Synthese und den Metabolismus von Pigmenten und könnte sogar die photosynthetischen Aktivitäten hemmen17,18,19; Daher wird freie Glukose im photosynthetischen Zellstoffwechsel selten synthetisiert oder im Übermaß angesammelt. Bei Cyanobakterien, einer Gruppe sauerstoffhaltiger prokaryotischer Mikroalgen, wurden einige Fortschritte erzielt, um die direkte Synthese und Sekretion von natürlichen oder nichtnatürlichen Zuckern durch genetische Manipulationen zu erleichtern20,21,22. Allerdings ist die photosynthetische Produktion von Glukose noch nicht gut untersucht. Die rekombinanten Stämme können nur begrenzte Mengen an Glukose produzieren, begleitet von der Produktion anderer Zucker, was darauf hindeutet, dass detailliertere Mechanismen des Glukosestoffwechsels in Photoautotrophen noch offengelegt werden müssen23,24.

In dieser Arbeit zielen wir darauf ab, eine direkte und stabile Umwandlung von Kohlendioxid in Glukose durch Cyanobakterien-Photosynthese zu erreichen. In einem Modell-Cyanobakterium Synechococcus elongatus PCC 7942 (im Folgenden kurz PCC 7942) identifizieren wir die native Glukokinaseaktivität als den Engpass, der das Stoffwechselpotenzial für die Glukosesynthese einschränkt. Durch das gezielte Ausschalten zweier Glukokinase-Gene wird der Kohlenhydratstoffwechsel gestört und ein Stoffwechselfluss in Richtung Glukose durch das Saccharose-Stoffwechselnetzwerk aktiviert, was im Allgemeinen als spezialisierte Reaktion auf osmotischen Stress angesehen wird. Die verbesserte Glukosesynthese fördert die Anreicherung einer spezifischen spontanen genomischen Mutation auf dem Chromosom von PCC 7942, was eine effiziente Glukosesekretion erleichtert. Durch die Implementierung mehrerer Omics-Ansätze in Kombination mit systematischen genetischen Manipulationen klären wir die Wege und Mutationen, die zur Glukosesynthese und -sekretion führen, und optimieren die Glukosesyntheseleistungen der rekombinanten Stämme. Durch anschließendes Metabolic Engineering und Kultivierungsoptimierung übersteigt die vom manipulierten Stamm sezernierte Glukose während der Langzeitkultivierung 5 g/L und macht bis zu 70 % der festen Kohlenstoffquelle aus.

Normalerweise sind drei Schritte erforderlich, um eine effiziente mikrobielle Produktion der Zielmetaboliten zu erreichen: Wege für die Synthese der Produkte zu konstruieren25,26, Reaktionen zu eliminieren, die solche Produkte verbrauchen27,28, und die Mechanismen für die Produktsekretion zu erleichtern20,23. Frühere Studien haben gezeigt, dass PCC 7942 mithilfe heterologer Glukosetransporter extrazelluläre Glukose für die Biomasseproduktion aufnehmen kann, was ihre natürliche Kapazität für den intrazellulären Glukoseverbrauch beweist29. Zwei Glukokinase-Gene (Synpcc7942_0221, glk1; Synpcc7942_2111, glk2), die Glukose phosphorylieren, um den EMP- oder OPP-Weg zu initiieren, wurden im PCC 7942-Genom annotiert, sodass sie als Knockout-Ziele ausgewählt wurden, um die intrazelluläre Glukose-Reassimilation zu blockieren.

Die Manipulationen wurden parallel unter Verwendung eines Wildtyp-PCC 7942 (WT) und eines rekombinanten Stamms durchgeführt, der einen aus E. coli stammenden Glukosetransporter GalP (SZ14, ergänzende Abbildungen 1 und 2) trug. Zuvor hat sich GalP als wirksam zur Erleichterung der Glukoseabsorption in PCC 794229,30 erwiesen, und hier verwenden wir es, um die Auswirkungen eines Glukokinasemangels auf die Glukoseverbrauchskapazitäten von PCC 7942 zu bewerten. Aufgrund der Polyploidieeigenschaften von Cyanobakterien sind Passagen mit Antibiotika erforderlich -Selektion erforderlich, um die gewünschten Homozygoten zu isolieren. Rekombinante Stämme, die ein inaktiviertes Glucokinase-Gen (glk1 oder glk2) trugen, konnten leicht erhalten werden, aber Homozygoten mit gleichzeitig inaktiviertem glk1 und glk2 im WT waren schwierig zu isolieren. Von mehreren unabhängigen Versuchen führte nur ein Prozess nach sechs Wochen kontinuierlicher Passagen zu einem homozygoten Stamm (SZ3) mit einem maßgeschneiderten Genotyp (vollständig blockiertes glk1 und glk2), während alle anderen fehlschlugen (was bedeutet, dass die Wildtyp-Kopie von glk1 bzw glk2 konnte nicht entfernt werden). Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass Glucokinase möglicherweise wesentliche physiologische Funktionen hat und möglicherweise sekundäre genomische Mutationen für die zelluläre Anpassung an den Mangel erforderlich sein könnten. Im SZ14-Stamm, der den GalP-Transporter trägt, konnte die homozygote Mutante (SZ17) mit gleichzeitig blockiertem glk1 und glk2 leichter isoliert werden, was darauf hindeutet, dass die GalP-Aktivität die durch den Glucokinase-Mangel verursachte Störung abfedern könnte.

Enzymatische Tests ergaben, dass beide Gene (glk1 und glk2) zur Glucokinase-Aktivität in PCC 7942 beitrugen und dass ihr gleichzeitiges Ausschalten die Glucokinase-Aktivität in SZ3 um etwa 70 % reduzierte; Beim SZ14-Stamm mit GalP-Transporter wurde die Glucokinase-Aktivität sogar noch deutlicher reduziert, indem die beiden Gene (in SZ17) auf ein niedrigeres Niveau als das von SZ3 ausgeschaltet wurden (Abb. 1a). Die verbleibenden Glucokinase-Aktivitäten könnten anderen unspezifischen Kinasen (z. B. Fructokinase und Phosphofructokinase) zugeschrieben werden. Die höhere verbleibende Glucokinase-Aktivität in SZ3 als in SZ17 deutete darauf hin, dass der Wildtyp-Hintergrund für die Aufrechterhaltung eines bestimmten Maßes an Glucokinase-Aktivität wesentlich zu sein schien, sodass der rekombinante Stamm einer langfristigen Domestizierung unterzogen wurde, um sich an den Verlust der Aktivitäten durch ungewisse Mechanismen anzupassen.

a Relative Glukokinaseaktivität von WT, SZ1 (Δglk1), SZ2 (Δglk2), SZ3 (Δglk1-Δglk2), SZ14 (ΔNS3::galP), SZ15 (ΔNS3::galP-Δglk1), SZ16 (ΔNS3::galP-Δglk2 ) und SZ17 (ΔNS3::galP-Δglk1-Δglk2), gewachsen unter autotrophen Bedingungen. b Wachstum von SZ14, SZ15, SZ16 und SZ17 in BG11-Kulturmedium mit oder ohne ergänzte Glucose. c Glukokinaseaktivität von SZ14, SZ15, SZ16 und SZ17, gezüchtet unter mixotrophen Bedingungen, ergänzt mit 30 mM Glucose. Die statistische Analyse wurde unter Verwendung des zweiseitigen, ungepaarten Student-t-Tests (*p < 0,05, ***p < 0,001) durchgeführt. Die p-Werte in (c) betragen (von links nach rechts) 0,013, 0,0003. Die Daten werden als Mittelwerte ± SD (n = 3 biologische Replikate) dargestellt. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Die Ergebnisse der mixotrophen Kultivierung bestätigten, dass der intrazelluläre Glukoseverbrauch in PCC 7942 gemäß dem Design verhindert wurde. Die Ergänzung mit Glukose (30 mM) verbesserte die Biomasseproduktion des SZ14-Stamms (der den GalP-Transporter trägt) um das Dreifache, wohingegen beim Glukokinase-defizienten Stamm keine Wachstumsverbesserung festgestellt wurde, was auf einen Verlust der Glukoseverwertungskapazität hinwies (Abb. 1b). ). Darüber hinaus führte die Ergänzung mit Glukose zur Wiederherstellung der Glukokinaseaktivität in den defizienten Stämmen (Abb. 1c), was auf eine adaptive Reaktion des PCC 7942-Stoffwechsels auf exogene Glukose hindeutet, einschließlich der Stimulierung unspezifischer Glukokinaseaktivitäten.

Die Ergebnisse des enzymatischen Tests deuteten darauf hin, dass Glucokinase-Aktivitäten für PCC 7942-Zellen essentiell sein könnten, um die Homöostase des Stoffwechsels aufrechtzuerhalten, während die Abhängigkeit durch die Einführung des Glucosetransporters GalP teilweise gelindert werden könnte. Angesichts der Auswirkungen von GalP auf die Abhängigkeit von nativer Glukokinase stellten wir die Hypothese auf, dass der Glukokinasemangel in PCC 7942 zu einer abnormalen Anhäufung spezifischer Metaboliten führen würde, die von GalP exportiert werden könnten, um die potenzielle Toxizität oder den Rückkopplungsstress zu lindern. Um diese Hypothese zu testen, untersuchten wir die sezernierten Metabolitenprofile der Glukokinase-defizienten Stämme (ergänzende Abbildung 3a) und stellten fest, dass sich im Kulturmedium erhebliche Mengen an Glukose ansammelten. Unter den gewählten Kultivierungsbedingungen (BG11-Medium, 100 μmol Photonen/m2/s, Lufteinblasen zur Kohlenstoffversorgung) wurden 1,0 g/L und 0,33 g/L Glucose durch SZ3 (WT-∆glk1-∆glk2) und SZ17 synthetisiert ( WT-∆glk1-∆glk2-∆NS3::galP) Stamm (Abb. 2). Darüber hinaus erfolgte die Akkumulation von Glukose im gleichen Tempo wie die zelluläre Biomasseproduktion, was darauf hindeutet, dass die extrazelluläre Glukose von den lebenden Zellen synthetisiert und abgesondert wurde und nicht aus dem Inhalt lysierter Zellen. Als die Kohlenstoffversorgung und die Beleuchtung weiter verbessert wurden (3 % CO2 v/v in Luft, 200 μmol Photonen/m2/s), stieg die Glukoseproduktion von SZ3 und SZ17 auf 1,64 g/L bzw. 1,16 g/L; und die Raten der beiden Stämme für die Ansammlung von Biomasse wurden ebenfalls verbessert. Während des Prozesses stiegen auch die intrazellulären Glukosekonzentrationen in den Glukokinase-Mangelstämmen an (ergänzende Abbildung 3b). Bei SZ3 wurden am 6. Tag etwa 5,6 mg/L/OD730-Glukose (über 70-fach höher als bei der Kontrolle) in den Zellen angesammelt, und bei SZ17 erreichte die intrazelluläre Glukosekonzentration bis zu 2,8 mg/L/OD730 .

Zelldichten (a) und extrazelluläre Glukosekonzentrationen (b) der Glukokinase-defizienten Stämme SZ3 und SZ17 wurden gemessen und verglichen. SZ3 und SZ17 wurden unter zwei Bedingungen mit unterschiedlicher Beleuchtungsstärke und Kohlenstoffversorgung kultiviert. Leere Symbole und gepunktete Linien stellen die Profile unter Kultivierungsbedingungen von 30 °C, 100 µmol Photonen/m2/s und Luftbelüftung dar; und durchgezogene Symbole und durchgezogene Linien stellen Profile aus den Kultivierungsbedingungen von 30 °C, 200 µmol Photonen/m2/s und 3 % CO2-belüftet dar. Die Daten werden als Mittelwerte ± SD (n = 3 biologische Replikate) dargestellt. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Um den möglichen Beitrag der organischen Kohlenstoffquelle im BG11-Medium zur Glucosesynthese auszuschließen, haben wir die Citrat- und Eisenamincitrat-Komponenten aus dem Medium entfernt, konnten jedoch keine negativen Auswirkungen auf die Glucoseproduktion feststellen, obwohl das Zellwachstum der rekombinanten Stämme leicht verringert war ( Ergänzende Abbildung 4a–c). Wir haben auch eine Isotopenmarkierungskultivierung durchgeführt, um die Beiträge organischer Kohlenstoffquellen zu bewerten. Wie in der ergänzenden Abbildung 4d – i gezeigt, konnte die synthetisierte Glucose schnell mit 13C markiert werden, wenn die rekombinanten Synechococcus-Zellen mit 13C-markiertem NaHCO3 kultiviert wurden, und die Zugabe oder Entfernung von Citrat und Eisenamincitrat hatte geringfügige Auswirkungen auf die Markierungsraten . Daher könnten wir vermuten, dass die von rekombinanten Stämmen sezernierte Glukose überwiegend aus der Umwandlung von anorganischem Kohlendioxid stammt. Im Vergleich zu früheren Berichten wurde in dieser Arbeit die photosynthetische Glukoseproduktion durch Cyanobakterien verbessert. Eine über zehnfach höhere Glukoseproduktivität (0,27 g/L/OD730 gegenüber 0,027 g/L/OD730) wurde erreicht, ohne dass katalytische Enzyme in Synechococcus eingeführt oder überexprimiert wurden. Darüber hinaus wurde die Glukosesynthese des rekombinanten PCC 7942 während der schnellen Wachstumsphase unabhängig von Umweltstressinduktionen (z. B. Salzstress oder Dunkelbehandlung) fortgesetzt23,24. Darüber hinaus sezernierte der SZ3-Stamm den Großteil der Glukose (>95 %, etwa 0,27 g/L/OD730 gegenüber 5,6 mg/L/OD730) unabhängig von heterologen Transportern, was darauf hindeutet, dass unbekannte Glukosetransportmechanismen durch den Glukokinasemangel aktiviert wurden.

Glukose wird in PCC 7942 im Allgemeinen nicht als intrazellulärer Hauptmetabolit erkannt, daher haben wir nicht erwartet, dass die Blockierung der Glukoseverbrauchskapazität einen großen Teil des Kohlenstoffflusses in Richtung Glukosesynthese verlagern würde. Theoretisch kann Glucose durch Dephosphorylierung von Glucose-1-Phosphat oder Glucose-6-Phosphat erzeugt werden, katalysiert durch Glucose-1-Phosphatase (EC 3.1.3.10) oder Glucose-6-Phosphatase (EC 3.1.3.9). Obwohl diese Gene in PCC 7942 nicht identifiziert wurden, gibt es andere Phosphatasen (alkalische Phosphatase, Synpcc7942_1392; anorganische Diphosphatase, Synpcc7942_1383; Fructose-1,6-bisphosphatase II/Sedoheptulose-1,7-bisphosphatase, Synpcc7942_0505; Fructose-1,6-bisphosphatase). , Synpcc7942_2335; Myo-Inositol-Monophosphatase, Synpcc7942_2582) könnte die Reaktionen unter Verwendung von Glucose-1-Phosphat oder Glucose-6-Phosphat als unspezifische Substrate katalysieren. In Anbetracht der Menge an angesammelter Glucose wäre ein wahrscheinlicherer Weg der Saccharose-Hydrolyseweg, über den UDP-Glucose und Fructose-6-Phosphat durch Saccharose-6-Phosphat-Synthase (sps, Synpcc7942_0808) katalysiert in Saccharose umgewandelt und erzeugt würden Saccharose konnte zu Glucose und Fructose hydrolysiert werden (invA, Synpcc7942_0397) (Abb. 3a). Um diese Hypothese zu bestätigen, haben wir die beiden Gene (SZ130, SZ3-ΔinvA; SZ131, SZ3-Δsps; ergänzende Abbildungen 5 und 6) ausgeschaltet und festgestellt, dass die Wachstumsrate nicht beeinträchtigt wurde, während die Glukosesekretion um etwa 90 % reduziert wurde auf 0,2 g/L (Abb. 3b, c). Das gleiche Phänomen wurde für den Stamm SZ17 beobachtet (Abb. 3d).

a Schematisches Stoffwechselnetzwerk der Glukoseerzeugung in PCC 7942. Zellwachstum (b) und Glukoseproduktion (c) von SZ3, SZ130 (SZ3-ΔinvA) und SZ131 (SZ3-Δsps). d Glukoseproduktion von SZ17 und SZ159 (SZ17-Δsps). Die Kultivierung wurde bei 30 °C, 200 µmol Photonen/m2/s und mit 3 % CO2 durchgeführt. Die Daten werden als Mittelwerte ± SD (n = 3 biologische Replikate) dargestellt. CBB-Zyklus Calvin-Benson-Bassham-Zyklus, Fru-1,6-bisP-Fructose-1,6-bisphosphat, Fru-6-P-Fructose-6-phosphat, UDP-Glc UDP-Glucose, Suc-6-P Saccharose-6 -Phosphat, Glc-6-P-Glukose-6-phosphat, Glc-1-P-Glukose-1-phosphat, Sps-Saccharose-Phosphat-Synthase, Spp-Saccharose-Phosphat-Phosphatase, Fk-Fructokinase, Pgi-Glucose-6-Phosphat-Isomerase, Pgm-Phosphoglucomutase , Fbp Fructose-1,6-bisphosphat I, Glpx Fructose-1,6-bisphosphatase II/Sedoheptulose-1,7-bisphosphatase, Galu UTP-Glucose-1-phosphat-Uridylyltransferase. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Die Ergebnisse zeigten, dass der Saccharosesyntheseweg die Glukoseakkumulation in den Glukokinase-defizienten Stämmen dominierte, was kontraintuitiv war, da die Saccharosesynthese normalerweise als induzierbarer physiologischer Schutzmechanismus zur Abwehr von hypersalinem Stress angesehen wird31. Um zu untersuchen, ob ein signifikanter Stoffwechselfluss über den Saccharosesyntheseweg in den Glucokinase-defizienten Stämmen unabhängig von der Induktion von Hypersaline-Stress aufrechterhalten wurde, konstruierten wir einen von SZ130 abgeleiteten Stamm, nämlich SZ153, der einen heterologen Saccharosetransporter Saccharose-Protonenpermease (CscB) trägt (Ergänzung). Abb. 7a, b), in denen der invA-Mangel die potenzielle Saccharosehydrolyse blockieren würde und die durch Isopropyl-beta-D-Thiogalactopyranosid (IPTG) induzierte cscB-Expression die Sekretion von angesammelter Saccharose erleichtern könnte (Abb. 4a). Wie in Abb. 4b gezeigt, gab es unter Standardbedingungen keinen signifikanten Unterschied zwischen der von den beiden Stämmen produzierten extrazellulären Glukose, wohingegen Saccharose kontinuierlich nur in SZ153 (bis zu 350 mg/l in 8 Tagen) mit IPTG-induzierter cscB-Expression sezerniert wurde. Durch die Expression von CscB wurde auch die intrazelluläre Saccharosekonzentration in SZ153 von 10 mg/L/OD730 auf etwa 2 mg/L/OD730 gesenkt, während die intrazelluläre Glukosekonzentration nicht beeinflusst wurde (Ergänzende Abbildungen 7c, d). Somit konnte bestätigt werden, dass ein Saccharosesynthesefluss in PCC 7942-Zellen unabhängig von Hypersaline-Stress aufrechterhalten wurde.

a Technische Strategien zur Erleichterung der Saccharose-Sekretion in PCC 7942. b Saccharose-/Glucose-Sekretion in SZ130 (Δglk1-Δglk2-ΔinvA) und SZ153 (Δglk1-Δglk2-ΔinvA-ΔNS3::cscB) mit oder ohne IPTG-Induktion. c Extrazelluläre Glucose- und Saccharoseansammlungen von FL92 (ΔNS3::cscB), SZ21 (ΔinvA-ΔNS3::cscB) und SZ153 (Δglk1-Δglk2-ΔinvA-ΔNS3::cscB) mit oder ohne IPTG-Induktion. Die Zellen wurden 8 Tage lang in BG11 gezüchtet. Die Daten werden als Mittelwerte ± SD dargestellt. Die gesamte Probengröße n (biologische Replikate) beträgt 6. Glk√ und Glk×: intakte bzw. defiziente Glukokinase; IPTG√: Stamm, der in Gegenwart von 0,1 mM IPTG gezüchtet wurde; IPTG×: Dem BG11-Medium wurde kein IPTG zugesetzt; CscB×: kein CscB im Stamm; CscB√: Stamm, der CscB exprimiert; Invertase √ und Invertase×: intakte bzw. defizitäre Invertase; CBB-Zyklus Calvin-Benson-Bassham-Zyklus, Fru-1,6-bisP-Fructose-1,6-bisphosphat, Fru-6-P-Fructose-6-phosphat, UDP-Glc UDP-Glucose, Suc-6-P Saccharose-6 -Phosphat, Glc-6-P-Glukose-6-phosphat, Glc-1-P-Glukose-1-phosphat, Sps-Saccharose-Phosphat-Synthase, Spp-Saccharose-Phosphat-Phosphatase, Fk-Fructokinase, CscB-Saccharose-Permease, Pgi-Glucose-6-Phosphat Isomerase, Pgm-Phosphoglucomutase, Fbp Fructose-1,6-bisphosphat I, Glpx Fructose-1,6-bisphosphatase II/Sedoheptulose-1,7-bisphosphatase, Galu UTP-Glucose-1-phosphat-Uridylyltransferase. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Weitere Experimente ergaben, dass die aktive Saccharosesynthese in PCC 7942 nicht mit einem Glukokinasemangel zusammenhängt. Die Saccharosesekretion durch CscB unter nicht-hypersalinen Bedingungen wurde auch für den Wildtyp-Hintergrund beobachtet. Im zuvor konstruierten Stamm FL92 (WT-ΔNS3::Plac-cscB)32 verbesserte die IPTG-induzierte cscB-Expression die extrazelluläre Saccharosesekretion. Der Knockout von invA (genannt SZ21, ergänzende Abbildung 8) verbesserte die Saccharosesekretion von 16 auf 80 mg/L, wenn kein IPTG hinzugefügt wurde (cscB wird in einem „undichten“ Zustand ausgedrückt). Bei Zugabe von 0,1 mM IPTG stieg die Saccharosesekretion aller drei Stämme weiter auf über 190 mg/l, und bei den Stämmen SZ21 und FL92 mit funktionellen Glukokinasen wurde eine geringere Glukosesekretion beobachtet (Abb. 4c). Basierend auf den obigen Ergebnissen gingen wir davon aus, dass in PCC 7942 ein aktiver Saccharose-Stoffwechselzyklus existierte und dass der Mangel an Glucokinase die Wiederverwendung von Glukose blockierte und die anschließende Akkumulation und Sekretion weiter förderte. In den Saccharosestoffwechsel-defizienten Stämmen wurde immer noch eine gewisse Menge an Glucose synthetisiert, was darauf hindeutet, dass es in PCC 7942 zusätzliche Wege gab, die zur Glucosesynthese beitrugen (z. B. potenzielle unspezifische Dephosphorylierungsaktivität).

Der Glukokinasemangel führte zu einer intrazellulären Akkumulation von Glukose, wohingegen die Mechanismen, die die anschließende Sekretion unabhängig von heterologen Transportern ermöglichen, noch offengelegt werden mussten. Im Glukokinase-defizienten Stamm SZ17 konnte die erzeugte Glukose über den heterologen Glukosetransporter GalP aus den Zellen exportiert werden, wodurch eine Überakkumulation intrazellulärer Glukose vermieden wurde. Im Vergleich dazu wären beim Stamm SZ3 genomische Mutationen erforderlich, um die Glukosesekretion zu erleichtern, was auch eine Erklärung für die für die Isolierung der Homozygoten erforderlichen Langzeitpassagen sein könnte. Zu diesem Zweck wurde eine Sequenzierung des gesamten Genoms durchgeführt, um die funktionellen Mutationen zu identifizieren, die die Glukosesekretion in SZ3 erleichtern. Basierend auf veröffentlichten Genominformationen von PCC 7942 (FACHB-805) wurden Mutationstypen im Genom von SZ3 und SZ17 charakterisiert (Ergänzungstabelle 1), von denen die meisten während der Konservierung und Passage des PCC 7942-Stamms in unserem Labor erzeugt wurden und wurden zuvor durch Genomsequenzierungstests identifiziert. Durch die Vergleiche zwischen SZ3 und SZ17 wurde ein spezifischer SNP (G274A) auf dem synpcc7942_1161-Gen des SZ3-Genoms identifiziert, auf dem das 92. Valin in Isoleucin umgewandelt wurde (Abb. 5a). Der Knockout von synpcc7942_1161 (G274A) im SZ3-Stamm (SZ141, ergänzende Abbildung 9) reduzierte die Glukosesekretion um 78 % auf 0,33 g/L und demonstrierte damit die wesentliche Rolle dieses Gens (Abb. 5b).

eine Sanger-DNA-Sequenzierung der amplifizierten synpcc7942_1161-Genregion von SZ3 und SZ17. b Auswirkung des synpcc7942_1161-Genmangels auf die Glukosesekretion des SZ3-Stammes. c Die Konstruktionsstrategie des Stammes SZ182 durch Einführung der synpcc7942_1161-G274A-Mutation in das Genom von PCC 7942; Als Kontrollstamm wurde SZ181 verwendet, das denselben eingefügten Antibiotikaresistenzmarker trug. Die Zahlen geben die erhöhte Faltung der jeweiligen Transkripthäufigkeit in SZ182 im Vergleich zu SZ181 an. d Überexpressionseffekt von synpcc7942_1161 (SZ192) auf die Glukoseproduktion des Stammes SZ17. e Die Konstruktionsstrategie zum Ersetzen des galP-Gens in SZ17 durch synpcc7942_1161 (mit oder ohne G274A-Mutation). f Vergleich der Wirkungen von synpcc7942_1161 und synpcc7942_1161-G274A auf die Förderung der Glukosesekretion bei Verwendung als Ersatz für GalP auf dem Chromosom von SZ17. Die Daten werden als Mittelwerte ± SD dargestellt. Alle Stichprobengrößen n (biologische Replikate) in (b, d und f) betragen 3. Alle Stichprobengrößen n (biologische Replikate) in (c) betragen 6. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Synpcc7942_1161 wurde mit Anmerkungen versehen, um einen zweiwertigen Metalltransporter mit fünf Transmembrandomänen zu kodieren (ergänzende Abbildung 10). Daher stellten wir die Hypothese auf, dass die G274A-Mutation die Affinitäten von Glucose zum Exporter der inneren Membran Synpcc7942_1161 verbessern und dadurch eine effizientere Glucosesekretion im SZ3-Stamm ermöglichen könnte. Ein anschließender Transkriptomtest deutete jedoch auf komplexere Auswirkungen der synpcc7942_1161-G274A-Mutation hin. Und unter den Transkripten mit deutlich erhöhter Häufigkeit im SZ3-Stamm war das Transkript synpcc7942_1161 am deutlichsten hochreguliert und erreichte eine bis zu 77-fache Steigerung. Darüber hinaus wurden vier weitere Gene, die sich im selben Operon mit synpcc7942_1161 befanden, ebenfalls signifikant hochreguliert (synpcc7942_1160 um das 37-fache, synpcc7942_1162 um das 59-fache, synpcc7942_1163 um das 37-fache und synpcc7942_RS13740 um das 34-fache), was die ersten fünf Gene darstellt -regulierte Transkripte in SZ3. Um herauszufinden, ob die erhöhten Transkriptionen durch die Mutation synpcc7942_1161-G274A verursacht wurden, haben wir diese Mutation in das PCC 7942 WT-Genom eingeführt (Abb. 5c und ergänzende Abb. 11) und die Transkriptomänderungen untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass die synpcc7942_1161-G274A-Mutation die Transkripthäufigkeit von drei Gen-kodierenden potenziellen Transportproteinen signifikant erhöhte (Abb. 5c und ergänzende Daten 1), was darauf hindeutet, dass die verstärkte Expression des Operons wahrscheinlich durch diese Mutation verursacht wurde.

Die Häufigkeit von Synpcc7942_1161 schien die Phänotypen der Glukosesekretion zu bestimmen, da die Überexpression des Wildtyp-Gens im SZ17-Stamm (SZ192, Abb. 5d und ergänzende Abb. 12) die Glukoseproduktion auf das Niveau von SZ3 erhöhte. Wir haben außerdem das GalP auf dem Chromosom von SZ17 durch den Wildtyp synpcc7942_1161 und eine mutierte Version synpcc7942_1161-G274A ersetzt und so JS155 bzw. JS156 erhalten (Abb. 5e). Wie in Abb. 5f gezeigt, sezernierten JS155 und JS156 vergleichbare Mengen an Glucose in die Kulturbrühe, die beide höher waren als SZ17. Und auch die intrazellulären Glukosekonzentrationen waren bei beiden Stämmen leicht verbessert. Daher kann auch vorgeschlagen werden, dass die synpcc7942_1161-G274A-Mutation die Glukosesekretion (in SZ3) hauptsächlich durch die Erhöhung der Transkripthäufigkeit von synpcc7942_1161 förderte, anstatt die spezifischen Aktivitäten des jeweiligen Transporters zu optimieren. Darüber hinaus haben wir die Stabilität von synpcc7942_1161-mRNA in JS155 und JS156 unter der Kontrolle des Plac-Promotors weiter bewertet und verglichen. Es wurde kein Unterschied zwischen den beiden Versionen von synpcc7942_1161-mRNA mit oder ohne G274A-Mutation festgestellt (ergänzende Abbildung 13). Daher könnte spekuliert werden, dass die erhöhte Häufigkeit von synpcc7942_1161-Transkripten eher auf die erhöhten Transkriptionsaktivitäten als auf die Optimierung der Transkriptstabilität zurückzuführen ist. Wir gingen auch davon aus, dass das mutierte synpcc7942_1161 zu einer unidirektionalen Transportfunktion von intrazellulärer Glukose beitragen könnte, da der Stamm PCC 7942 WT, der die Mutation synpcc7942_1161-G274A trägt, keine Glukose absorbieren konnte (ergänzende Abbildung 14). Basierend auf den obigen Ergebnissen gingen wir von einem Modell für die Entstehung des Glukokinase-defizienten Stamms SZ3 aus. Wie in Abb. 6 gezeigt, blockierte der Glukokinasemangel den Glucose-6-Phosphat-Glukose-Zyklus und verstärkte die spontane Mutation von synpcc7942_1161-G274A. Das synpcc7942_1161-G274A könnte die Glukosesekretion fördern, indem es die Häufigkeit oder Aktivität des inneren Membranexporters Synpcc7942_1161 erhöht, wodurch die Glukosesekretion effizienter initiiert wird. Schließlich pufferten die erhöhten Glukosesekretionen den potenziellen Rückkopplungsstress und ermöglichten die Isolierung des endgültigen Homozygoten von SZ3.

CBB-Zyklus Calvin-Benson-Bassham-Zyklus, Fru-1,6-bisP-Fructose-1,6-bisphosphat, Fru-6-P-Fructose-6-phosphat, UDP-Glc UDP-Glucose, Suc-6-P Saccharose-6 -phosphat, Glc-6-P-Glukose-6-phosphat, Glc-1-P-Glukose-1-phosphat, Sps-Saccharose-Phosphat-Synthase, Spp-Saccharose-Phosphat-Phosphatase, Fk-Fructokinase, 1161: synpcc7942_1161-Gen, Pgi-Glucose-6- Phosphatisomerase, Pgm-Phosphoglucomutase, Fbp Fructose-1,6-bisphosphat I, Glpx Fructose-1,6-bisphosphatase II/Sedoheptulose-1,7-bisphosphatase, Galu UTP-Glucose-1-phosphat-Uridylyltransferase.

Die globale RNA-Sequenzierungsanalyse ergab, dass das Transkriptom in SZ3 umgestaltet wurde und die Expression von 581 Genen im Vergleich zu WT signifikant reguliert war (227 hochreguliert und 354 herunterreguliert, Ergänzungsdaten 2). Die Anreicherungsanalyse ergab, dass die an der Photosynthese und oxidativen Phosphorylierung beteiligten Wege in SZ3 (ergänzende Abbildung 15) signifikant reguliert waren (p-Wert <0, 01), und dies stimmte mit den abgeschwächten Photosyntheseaktivitäten (Sauerstoffentwicklungsraten; ergänzende Abbildung 16) in überein SZ3 im Vergleich zu WT. Mittlerweile zeigen viele Gene, die am Stickstoffstoffwechsel und Aminosäurestoffwechsel in SZ3 beteiligt sind, auch veränderte Transkriptionsniveaus, die mit dem aktiven „Carbon Spilling“-Status im Glucokinase-Mangelstamm verbunden sind, insbesondere bei denen, die eng mit dem Stickstoffstoffwechsel verbunden sind. Um die Auswirkungen des Glucokinase-Mangelstoffwechsels weiter aufzuklären, wurden ungezielte Metabolomics-Assays zwischen SZ3 und dem Wildtyp durchgeführt. Durch LC-MS/MS-Assays wurden 116 differenzierte Metaboliten identifiziert (Supplementary Data 3, 4). Im Einklang mit der Transkriptomveränderung wurde die Konzentration mehrerer Aminosäuren in SZ3 verändert. Beispielsweise wurden die Konzentrationen von Arginin, Glutamat und Glutamin, die am Ornithin-Ammoniak-Zyklus33 beteiligt sind, allesamt um über 50 % reduziert (Abb. 7). Ein weiteres repräsentatives metabolomisches Merkmal des Glukokinase-defizienten Stamms SZ3 war die erhöhte Häufigkeit von Zuckerverbindungen und der verringerte Gehalt an phosphorylierten Metaboliten (Ergänzungstabellen 2 und 3). Dieses Phänomen deutete darauf hin, dass Glucokinasen möglicherweise als unspezifische Phosphorylasen mit breiteren Substraten im PCC 7942-Metabolismus fungieren, was auch die Schwierigkeit erklären könnte, die Homozygoten mit Glucokinase-Mangel zu isolieren. Um diese Hypothese zu bestätigen, haben wir Glk1 und Glk2 von PCC 7942 gereinigt und die Aktivitäten der beiden Enzyme bei der Phosphorylierung anderer Zucker als Glucose bewertet. Wie in der ergänzenden Abbildung 17 gezeigt, zeigten beide Glucokinasen Phosphorylierungsaktivitäten bei einigen anderen Zuckern außer Glucose. Die unspezifischen Aktivitäten von Glk2 gegenüber den acht Zuckern übersteigen alle 20 % (der spezifischen Aktivität für Glucose) und erreichen bis zu 50 % für Fructose, Mannose und Galactose. Die In-vitro-Testergebnisse lieferten weitere Beweise für die Hypothese, dass Glucokinasen eine wichtige Rolle bei der Phosphorylierung und dem Recycling von Zuckern in PCC 7942 spielen könnten. Darüber hinaus wurden mehrere phosphorylierte Metaboliten mit verringerten Konzentrationen (Ribulose-5-phosphat, Dihydroxyacetonphosphat, Fructose-6-phosphat) gefunden. Phosphat und Erythrose-4-phosphat) sind am CBB-Zyklus beteiligt (Abb. 7), wobei die verminderte Häufigkeit auch auf den durch die Glukosesynthese und -sekretion verursachten Kohlenstoffmangel zurückzuführen sein könnte.

Relative Mengen intrazellulärer Metaboliten von WT (weiße Säule) und SZ3 (graue Säule), gewachsen unter Standardkultivierungsbedingungen (BG11-Medium, 100 μmol Photonen/m2/s, Luftblasen zur Kohlenstoffversorgung) für 8 Tage. Metaboliten von SZ3, die im Vergleich zu WT signifikant zu- oder abnahmen, sind rot bzw. blau gekennzeichnet. Die Daten werden als Mittelwerte ± SD dargestellt. Alle Probengrößen n (biologische Replikate) betragen 6. CBB-Zyklus Calvin-Benson-Bassham-Zyklus, TCA-Zyklus Tricarbonsäurezyklus, ED-Weg Entner-Doudoroff-Weg, FBP-Fructose-1,6-bisphosphat, Fbp-Fructose-1,6-bisphosphat I, Glpx Fructose-1,6-bisphosphatase II/Sedoheptulose-1,7-bisphosphatase, Galu UTP-Glucose-1-phosphat-Uridylyltransferase, F6P Fructose-6-phosphat, UDP-Glc UDP-Glucose, Suc-6-P Saccharose -6-Phosphat, G6P Glucose-6-Phosphat, G1P Glucose-1-Phosphat, Sps Saccharose-Phosphat-Synthase, Spp Saccharose-Phosphat-Phosphatase, Fk-Fructokinase, Glk-Glucokinase, E4P Erythrose-4-Phosphat, SBP Sedoheptulose-1,7 -Bisphosphat, S7P Sedoheptulose-7-Phosphat, GAP Glycerinaldehyd-3-Phosphat, R5P Ribose 5-Phosphat, ADP-Glc Adenosindiphosphatglukose, Pgm Phosphoglucomutase, Pgi Glucose-6-Phosphat-Isomerase, 3PGA 3-Phosphat-Glycerat, 6PG 6-Phosphogluconsäure, KDPG 2-Keto-3-Desoxy-6-Phosphogluconat, PYR Pyruvat, Glu15La Glucono- 1,5-Lacton, UDP-Gal UDP-Galactose, Gal Galactose, Gal-1P Galactose 1-Phosphat, PEP Phosphoenolpyruvat, AcCoA Acetyl-CoA, CIT Citrat, ICIT Isocitrat, 2OG 2-Oxoglutarat, SUC-CoA Succinyl CoA, SUC Succinat, FUM-Fumarat, OAA-Oxalacetat, MAL-Malat. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Was den Saccharose-Stoffwechselweg betrifft, der die Glukosesynthese direkt unterstützt, wurde die Häufigkeit der wichtigen Zwischenmetaboliten unterschiedlich reguliert, was auf einen unausgewogenen katalytischen Weg hindeutet (Abb. 7). Im Vergleich zur Wildtyp-Kontrolle sank die intrazelluläre Saccharosekonzentration um 74,3 %, während die von Fructose um das Achtfache anstieg. Diese Ergebnisse deuten auf eine starke Triebkraft für die Glukosesekretion und eine erhöhte Fruktoseproduktion hin, die die Umwandlungskapazität der nativen Fruktokinase übersteigt. Die Konzentrationen der meisten vorgelagerten Metaboliten nahmen im Allgemeinen ab (um 88,3 % für Glucose-1-phosphat, 88,4 % für Glucose-6-phosphat, 69,9 % für Fructose-1,6-bisphosphat und 97,7 % für Fructose-6-phosphat). außer UDP-Glukose (2,93-facher Anstieg). Die funktionellen Enzyme, die für die Umwandlung von Glucose-1-phosphat in UDP-Glucose verantwortlich sind, wurden in PCC 794234 nicht identifiziert. Daher sollten die Mechanismen, die die Überakkumulation von UDP-Glucose verursachen, in zukünftigen Studien weiter untersucht werden.

Um die photosynthetische Glukoseproduktion weiter zu verbessern, wurden mehrere essentielle Enzyme der Saccharosestoffwechselwege einzeln überexprimiert. Wie in Abb. 8 gezeigt, sind die bifunktionelle Saccharose-6-Phosphat-Synthase/Saccharose-6-Phosphotase (die die Synthese von Saccharose-6-Phosphat und Saccharose aus Fructose-6-Phosphat und UDP-Glucose katalysiert), die Invertase (die die Abbau von Saccharose zu Fructose und Glucose), die Phosphoglucose-Isomerase (katalysiert die Umwandlung zwischen Fructose-6-phosphat und Glucose-6-phosphat), die Phosphoglucose-Mutase (katalysiert die Umwandlung zwischen Glucose-1-phosphat und Glucose-6-phosphat) , die Fructose-1,6-bisphosphatase (die die Umwandlung von Fructose-1,6-bisphosphat zu Fructose-6-phosphat katalysiert) wurden im SZ3-Stamm alle einzeln überexprimiert. Die meisten rekombinanten Stämme führten zu einer gesteigerten Glukoseproduktion und verbesserten die extrazellulären Glukosekonzentrationen während eines 16–18-tägigen Kultivierungsprozesses von etwa 1,6 auf 2 g/L. Die einzige Ausnahme war die Überexpression von Fructokinase, bei der die Glukosesekretion verringert war. Eine mögliche Erklärung ist, dass die erhöhten Fructokinase-Enzyme Glucose als unspezifisches Substrat katalysierten und den zuvor blockierten Glucose/Phosphoglucose-Zyklus wiederherstellten (ergänzende Abbildung 18), was zu einer Reduzierung des Glucosesynthesezweigs führte.

Extrazelluläre Glukoseproduktion und Zelldichte mutierter Stämme, berechnet nach einer 15–18-tägigen Kultivierung. Die Ergebnisse für SZ145 und SZ150 sind die extrazelluläre Glukoseproduktion vom 16. bzw. 15. Kulturtag. Die statistische Analyse wurde mithilfe des zweiseitigen, ungepaarten Student-t-Tests durchgeführt (**p < 0,01, ****p < 0,0001). Die p-Werte sind (von links nach rechts) 0,0029, 0,0026, 0,0011, 0,0049, <0,0001, 0,0017, <0,0001. Die Daten werden als Mittelwerte ± SD dargestellt. Die gesamte Probengröße n (biologische Replikate) beträgt 3. Die Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Wie oben erwähnt, verbesserte die Optimierung der Kohlenstoffversorgung und der Beleuchtungsstärken die Glukoseproduktion der SZ3- und SZ17-Stämme sowie die Biomasseakkumulationsraten. Wir verwendeten den Stamm SZ123, um die Glukoseproduktion durch Kultivierungsoptimierung zu verbessern, und die Ergebnisse zeigten eine verbesserte Biomasse- und Glukoseproduktion (von 2 auf 2,9 g/l; Abb. 9a; ergänzende Abb. 19) unter Verwendung von konzentriertem (2×) BG11-Kulturmedium35. Für eine längere Glukosesynthese haben wir eine Fed-Batch-Strategie übernommen, indem wir die Glukose synthetisierenden Zellen alle 12 Tage erneut suspendierten (d. h. die Zellen ernteten und mit frischem Medium suspendierten). Diese Strategie verlängerte effektiv die Glukosesyntheseaktivitäten der SZ123-Zellen (Abb. 9b) und führte nach 3 Chargen zur Akkumulation von 5 g/L Glukose, die über 70 % des von den rekombinanten Synechococcus-Zellen fixierten Kohlenstoffflusses aufnahm ( Ergänzende Abbildung 20). Die Glukoseakkumulationsraten nahmen mit der Abnahme der Zelldichte allmählich ab. Daher ist die zelluläre Robustheit der rekombinanten Zellfabriken zur Aufrechterhaltung eines stabilen Wachstums und Stoffwechsels bei Langzeitkultivierung der Hauptfaktor für die Kontrolle der Glukoseproduktion. Dementsprechend sollten künftige systematische Lösungen zur Sorten- und Anbautechnik diese Aspekte weiter verbessern.

a Wirkung der Kulturmedienergänzung auf die Glukoseproduktion des Stammes SZ123. Die statistische Analyse wurde mithilfe des zweiseitigen, ungepaarten Student-t-Tests durchgeführt (***p < 0,001, ****p < 0,0001). Die p-Werte betragen (von links nach rechts) 0,0001, <0,0001. b Resuspensionskontinuierliche Kultur des Stammes SZ123 basierend auf (2×) BG11-Medium. Die Daten werden als Mittelwerte ± SD dargestellt. Die gesamte Stichprobengröße n (biologische Replikate) in (a) beträgt 4. Die gesamte Stichprobengröße n (biologische Replikate) in (b) beträgt 3. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

In dieser Arbeit haben wir das Potenzial der Cyanobakterien-Photosynthese erschlossen, Kohlendioxid direkt in Glukose umzuwandeln. Die Photosynthese ist der umfangreichste biochemische Prozess auf der Erde, und Photoautotrophe wandeln Sonnenenergie und Kohlendioxid in primären organischen Kohlenstoff um, um die Erhaltung der Biosphäre zu unterstützen36. Derzeit ist die Raffinierung von zuckerreicher Pflanzen-/Algenbiomasse der vorherrschende Weg zur Produktion von Zucker in großen Mengen und deckt den Bedarf der Lebensmittel- und Medizinbranche sowie der Bioraffinerieindustrie8,9. Der „Ein-Topf-, Ein-Schritt“-Modus der Photosyntheseproduktion von Cyanobakterien könnte als kontinuierlichere, stabilere und effizientere Zuckeralternative dienen als der „Pflanzen-Biomasse-Zucker“-Weg37. Die meisten Cyanobakterienarten können auf natürliche Weise zuckerverträgliche gelöste Stoffe synthetisieren und anreichern, um abiotischem Umweltstress zu widerstehen38. Die Akkumulation und Sekretion dieser kompatiblen Zuckerverbindungen (wie Saccharose und Trehalose) durch Cyanobakterien kann durch genetische Manipulation20,21 optimiert werden, und biotechnologische Anwendungsszenarien wie die Entwicklung künstlicher Konsortien werden erforscht und erweitert39,40. Allerdings kann Glucose, das repräsentativste und wichtigste Monosaccharidmolekül, in Cyanobakterien nicht effizient synthetisiert und akkumuliert werden. Kürzlich wurde bei einem PCC 7942-Mutanten mit deletiertem xpk-Gen (das für Phosphoketolase kodiert) eine Glukosesekretion (begleitet von einer Saccharosesekretion) beobachtet. Diese Glukosesynthese kann jedoch nur im Dunkeln unter Salzstressbedingungen ausgelöst werden, und der Titer ist eher begrenzt und erreicht bei Zellen mit hoher Dichte etwa 3 mM (die anfängliche OD730 beträgt 20 und die endgültige durchschnittliche Produktivität 0,027 g/L). /OD730)24. In einer anderen, früher veröffentlichten Arbeit erreichte der Titer der salzinduzierten Glucosesynthese (begleitet von der Fructosesekretion) in PCC 7942 durch Überexpression von Saccharosehydrolase und Hexosetransportern nur 30 μM (Produktivität von 0,027 g/L/OD750)23. Im Gegensatz dazu wurde in dieser Arbeit eine kontinuierliche Synthese von Glucose während der schnellen photoautotrophen Wachstumsphase mit einer Produktivität von mehr als 0,27 g/L/OD730 erreicht, indem einfach die Glucokinase-Aktivitäten in Synechococcus-Zellen entfernt wurden, was eine zehnfach höhere Photosyntheseproduktivität bedeutet, wenn keine vorhanden ist heterologe katalytische Enzyme oder Transporter und unabhängig von jeglichen Umweltstressinduktionen.

Obwohl ein Großteil der isolierten Cyanobakterienarten einen autotrophen Stoffwechsel durchführt und nicht in der Lage ist, exogene Glukose als Kohlenstoffquelle zu absorbieren und zu nutzen, sind einige Cyanobakterienstämme in der Lage, Glukose zu nutzen41,42. Bei den Cyanobakterienstämmen, die einen heterotrophen oder mixotrophen Stoffwechsel unter Verwendung von Glukose durchführen können, spielt Glukokinase eine wesentliche Rolle bei der Phosphorylierung von Glukose und der Auslösung der verschiedenen glykolytischen Prozesse43,44. Glucokinase-Gene sind jedoch in der überwiegenden Mehrheit der sequenzierten Cyanobakteriengenome allgegenwärtig (Supplementary Data 5). Beispielsweise weist Synechococcus elongatus PCC 7942, dem nachweislich die Fähigkeit fehlt, exogene Glukose zu absorbieren und zu nutzen, zwei Glukokinase-Gene in seinem Genom auf, was bedeutet, dass Glukokinase mehr physiologische Funktionen als die Glukoseverwertung hat. Durch systematische genetische Veränderungen identifizierten wir in PCC 7942 einen aktiven und stabilen Glucose-Phosphoglucose-Zyklus, der im Saccharose-Stoffwechselweg aufrechterhalten wurde. Zuvor galt die Saccharosesynthese und -akkumulation allgemein als ein auf Salzstress reagierender Mechanismus zur Abwehr von hyperosmotischem Stress31,45. Im Gegensatz dazu haben wir in dieser Arbeit gezeigt, dass der Synthese-Abbau-Zyklus von Saccharose in PCC 7942 unabhängig von der Stressinduktion durch Salze aktiv bleibt und die Glucokinase-Aktivität als „Schleusentor“ fungiert, um die Überakkumulation von Glucose zu verhindern, die ein Zwischenprodukt in der ist Saccharosestoffwechselnetzwerk und hat potenziellen Einfluss auf den Photosynthesestoffwechsel. Neben dem Saccharosestoffwechsel können auch einige andere unspezifische Reaktionen zur Synthese und Akkumulation von Glucose in PCC 7942 beitragen. Daher könnte angenommen werden, dass die intrazelluläre Glucosesynthese in PCC 7942 kontinuierlich aufrechterhalten werden kann, wohingegen Glucokinase für die Wiederverwertung von Glucose in PCC 7942 von entscheidender Bedeutung war das zentrale Stoffwechselnetzwerk durch einen Phosphorylierungsprozess, und dieser Mechanismus kann möglicherweise den potenziellen Energieverlust und die Stoffwechselstörung, die durch die Sekretion und Ansammlung von Glukose verursacht werden, beheben. Obwohl das Zellwachstum und die Photosynthese nicht gehemmt wurden (ergänzende Abbildung 16), zeigten Glukokinase-defiziente Stämme darüber hinaus eine verbesserte Empfindlichkeit gegenüber 150 mM NaCl (ergänzende Abbildung 21), was darauf hindeutet, dass der stabile Glucose-Phosphoglucose-Zyklus zur schnellen Reaktion beiträgt von PCC 7942 gegenüber Salzstress. Zuvor wurde nachgewiesen, dass der ionische Effekt wichtig für die Anreicherung von Saccharose in PCC 7942 ist, wobei eine erhöhte Ionenkonzentration das Saccharose-synthetisierende Enzym Sps direkt aktiviert und gleichzeitig das Saccharose-abbauende Enzym Inv31 hemmt. Die Aufrechterhaltung des Saccharose-Stoffwechselzyklus ermöglichte die direkte Aktivitätsregulierung der Ionenkonzentrationen der Enzyme, und die Glucokinase-Aktivitäten könnten die schnelle Wiederverwendung von Zuckern (Fructose und Glucose) aus hydrolysierter Saccharose gewährleisten (die Aktivität von Inv würde eher reduziert als). durch erhöhte Ionenkonzentrationen vollständig entfernt).

Ein wichtiges Thema im mikrobiellen Stoffwechsel-Engineering ist die Anpassung von Chassiszellen an künstliche Signalwege und genomische Veränderungen. Die blockierten und neu verkabelten Stoffwechselaktivitäten können die Kohlenstoffverteilung, die Co-Faktor-Versorgung und das Redoxgleichgewicht des natürlichen Zellstoffwechsels stören und neigen dazu, die Reaktionen der Wirtszellen auf physiologischer, metabolischer und sogar genetischer Ebene zu stimulieren46 sollten durch Stoffwechseldesigns und -technik gelindert werden. Transporter-Engineering ist zu einer universellen Strategie geworden, um die Anpassungsfähigkeit mikrobieller Chassiszellen an heterologe Wege zu erhöhen, was die Produktsekretion fördern, die metabolische Belastung durch intrazelluläre Überakkumulation verringern und die potenzielle Hemmwirkung der Produkte verringern könnte47. In dieser Studie wurde eine alternative Lösung vorgeschlagen. Um einen effektiven Glukosetransport zu erreichen, führten wir einen heterologen Transporter GalP auf dem Chromosom von PCC 7942 ein, der den potenziellen intrazellulären metabolischen oder physiologischen Stress reduzierte und die bequeme und reibungslose Erfassung der genetischen Transformanten (SZ17) erleichterte. Im Vergleich dazu wurde ohne Einführung heterologer Transporter eine spontane Mutation (Synpcc7942_1161-G274A) während des Langzeitkultivierungsprozesses erzeugt und angereichert, die dem mutierten Stamm noch bessere Kapazitäten für die Glukosesynthese und -sekretion verlieh. Die Kombination künstlicher genetischer Veränderungen mit metabolischen Stress-induzierten spontanen genomischen Mutationen könnte den Stoffwechselfluss effektiver neu steuern.

Zusammenfassend haben wir die Schlüsselfaktoren identifiziert, die das natürliche Potenzial von Cyanobakterien für die photosynthetische Produktion von Glukose einschränken. Ohne heterologe Katalyse oder Transportgene wurde ein großer Teil des photosynthetisch fixierten Kohlendioxids im gentechnisch veränderten Stamm mit mangelnden Glukokinaseaktivitäten und einer spontanen Genommutation in die sekretorische Produktion von Glukose umgeleitet. Die Entdeckungen geben Aufschluss über die Entwicklung und Industrialisierung gezielterer und kontinuierlicherer Glukoseproduktionssysteme mit Solarenergie und Kohlendioxid.

Alle endogenen Gene wurden mittels PCR aus dem Wildtyp-PCC 7942-Genom unter Verwendung genspezifischer Primer und High-Fidelity-DNA-Polymerase (TransGen, Peking, China) amplifiziert. Alle in dieser Studie verwendeten Primer und die konstruierten Plasmide sind in den ergänzenden Daten 6 aufgeführt. Der E. coli-Stamm DH5α wurde zur Konstruktion der Plasmide verwendet, und alle Stämme wurden bei 37 ° C im Luria-Bertani-Medium (Flüssigkeit oder Agar-Petri) gezüchtet Gericht) ergänzt mit entsprechenden Antibiotika (Solarbio). Ampicillin, Kanamycin, Spectinomycin, Gentamycin und Chloramphenicol wurden in Mengen von 100, 50, 50, 40 bzw. 50 µg/ml für Stämme mit entsprechenden Resistenzgenen verwendet. Alle Rückgratvektoren wurden basierend auf pUC19 oder pBR322 durch Einfügen homologer Regionen, Promotoren und Antibiotikaresistenzkassetten mit Restriktionsenzymverdauung und Ligation oder nahtloser Klonierung definiert. Die homologen Rekombinationsregionen in allen Plasmiden befanden sich etwa 1000 bp stromaufwärts der Sequenz und 1000 bp stromabwärts der Sequenz des integrierten Genlocus. EcoRI, XbaI, EcoRV, NaeI, EagI und BamHI waren die Restriktionsklonierungsstellen, die zur Konstruktion von pSS1 und pSS2 verwendet wurden. Alle Restriktionsenzyme waren Schnellverdauungsenzyme von Thermo Fisher Science (Shanghai, China). Die Plasmide wurden unter Verwendung der Seamless-Klonierungsmethode und des Seamless Assembly Cloning Kit (Taihe Biology Co., LTD, China) gemäß den Anweisungen des Herstellers konstruiert. E. coli-Kolonien mit positiven Plasmiden wurden durch Kolonie-PCR unter Verwendung genspezifischer Primer und Taq-DNA-Polymerase (TransGen Biotech) bestätigt. Mit einem Mini-Prep-Kit (OMEGA Bio-Tek) gereinigte Plasmide wurden vor der PCC 7942-Transformation durch Sanger-Sequenzierung überprüft.

Die genetischen Veränderungen des PCC 7942-Genoms wurden mithilfe eines doppelten homologen Rekombinationssystems durchgeführt, um die Gene in die Zielstellen zu integrieren. Alle Plasmide wurden durch die natürliche Transformation in PCC 7942 transformiert. Auf antibiotikaselektiven Platten gezüchtete Transformanten wurden mittels PCR und DNA-Sequenzierung der zweiten Generation der amplifizierten Fragmente analysiert32. Die in dieser Studie konstruierten, von PCC 7942 abgeleiteten Stämme sind in den Zusatzdaten 7 aufgeführt.

Von PCC 7942 abgeleitete Stämme wurden in flüssiges BG11-Medium, das die entsprechenden Antibiotika enthielt, inokuliert und 4–6 Tage lang unter Rotationsschütteln (150 U/min) und Weißlichtbeleuchtung mit 50 µmol Photonen/m2/s bei 30 °C kultiviert. Anschließend wurde die Kulturbrühe in 200 ml BG11-Medium in 250-ml-Kolben unter kontinuierlichem Weißlicht von 100 µmol Photonen/m2/s inokuliert und mit Luft durchströmt. Dem Medium wurden Kanamycin, Spectinomycin, Gentamicin und Chloramphenicol in Endkonzentrationen von 20, 20, 2 bzw. 10 µg/ml zugesetzt. Abschließend wurde die Kulturbrühe aus den Kolben zentrifugiert und mit 65 ml frischem BG11-Kulturmedium bis zur anfänglichen OD730 von etwa 2,0 in Säulen-Photobioreaktoren (mit einem Durchmesser von 3 cm) resuspendiert. Sofern nicht ausdrücklich anders angegeben, wurden die Kultivierungen zur photosynthetischen Glukoseproduktion bei 30 °C durchgeführt. Während des Langzeitkultivierungsversuchs wurden Antibiotika eliminiert, 8 mM TES-NaOH (pH = 8) hinzugefügt, um den pH-Wert der Kultur aufrechtzuerhalten, und die Genotypen der Zellen wurden am Ende der Kultivierung mittels PCR überprüft. Während des Kultivierungsprozesses wurden jeden zweiten Tag 0,5 ml Kulturbrühe aus jedem Säulen-Photobioreaktor entnommen, um die OD730- und Glukosekonzentrationen zu messen, und steriles Wasser wurde ergänzt, um das ursprüngliche Volumen beizubehalten. Für spezielle Experimente würden die organischen Kohlenstoffanteile (Zitronensäure und Eisen-Ammoniumcitrat) aus dem BG11-Medium entfernt.

Um den extrazellulären Glukosegehalt zu bestimmen, der von den von PCC 7942 abgeleiteten Stämmen sezerniert wurde, wurden Proben der Kulturbrühe entnommen und 1 Minute lang bei 12.000 × g zentrifugiert. Dann wurden die Glukosekonzentrationen im Überstand unter Verwendung des D-Glukose-Assay-Kits (Megazyme) oder des Ionenaustauschchromatographiesystems ICS5000+ (DIONEX, Thermo Scientific, USA) berechnet, das mit einem elektrochemischen Detektor und einer analytischen Säule Dionex CarboPac MA1 (4×250) ausgestattet war mm, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). Intrazelluläre Glukose wurde nach einer früheren Studie aus Zellpellets extrahiert48. Kurz gesagt, die Zellpellets wurden in 1 ml 80 %igem Ethanol (Volumen zu Volumen) resuspendiert und dann 4 Stunden lang bei 65 °C inkubiert. Nach 5-minütiger Zentrifugation bei 12.000 × g wurde der Überstand in ein sauberes Röhrchen überführt und unter einem N2-Strom bei 55 °C getrocknet. Anschließend wurden die trockenen Rückstände in hochreinem Wasser gelöst und die gelöste Lösung mit einer 0,22 μm-Filtrationsmembran in saubere Fläschchen filtriert. Der Glukosegehalt im Filtrat wurde ebenfalls mithilfe des D-Glukose-Assay-Kits (Megazyme) oder der Ionenchromatographie berechnet.

Die Glucokinase-Aktivität wurde mit einem modifizierten enzymgebundenen Assay3 gemessen. In BG11-Medium kultivierte Synechococcus-Zellen wurden zentrifugiert und in 1 ml auf 4 °C vorgekühltem Bruchpuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,4) resuspendiert. Der Zellsuspension wurde Quarzsand (Sigma) zugesetzt und die Zellen wurden durch 30-minütiges Vortex-Mischen bei 4 °C aufgeschlossen. Nach der Zentrifugation wurden 60 µL des Überstands in eine 96-Well-Platte überführt, zu der 200 µL eines Reaktionspuffers (100 mM Tris-HCl, pH 7,8, 2,5 mM ATP, 4 mM MgCl2, 20 mM KCl, 0,2 mM NADP+) gegeben wurden , 10 mM Glucose und 5 U/ml Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase) zugegeben und die Absorption bei 340 nm alle 5 Minuten im Dunkeln gemessen. Die Steigung von A510, die mit der Zeit zunahm, wurde berechnet und die spezifische Enzymaktivität der Glucokinase in der Reaktionsmischung wurde gemäß dem Lambert-Beer-Gesetz berechnet.

Die 13C-Markierungsexperimente wurden mit 13C-markiertem Natriumbicarbonat (Cambridge Isotope Laboratories, 99 % 13C, CLM-441) durchgeführt und 12C-NaHCO3 wurde als Kontrolle zugesetzt. Zuerst wurden Zellen in der exponentiellen Wachstumsphase in 10 ml BG11, einschließlich 50 mM NaHCO3 und geeigneten Antibiotika, auf eine OD730 von 0,6 eingestellt und dann in versiegelten 30-ml-Flaschen (ohne Kopfraum) mit oder ohne Zitronensäure und Ammoniumeisencitrat kultiviert kontinuierliche Lichtverhältnisse. Zur Untersuchung der intrazellulären Metaboliten wurden die Zellen alle 24 Stunden durch Zentrifugation gesammelt, schnell mit 2 ml 80:20 Methanol/Wasser (Vol./Vol.) extrahiert und dann in flüssigem Stickstoff eingefroren. Intrazelluläre Metaboliten wurden fünfmal über den Einfrier-/Auftauzyklus extrahiert. Nach Zentrifugation und Einblasen von Stickstoff wurden der Probe 100 µL ddH2O zur Resuspension zugesetzt und für die Derivatisierungsreaktion verwendet. Die Probenderivatisierung erfolgte in zwei Schritten: (1) Zugabe von 40 µL Methoxyaminlösung (25 mg/ml, gelöst in Pyridinlösungsmittel) und anschließende Inkubation bei 60 °C für 30 Minuten. (2) 40 µL TMS-Reagenz (BSTFA/TMCS, 99:1) wurden zu jeder Probe gegeben und dann 120 Minuten bei 37 °C umgesetzt. Zur Bestimmung der extrazellulären Glucose wurden 100 µL Überstand der SZ3-Kulturbrühe zur Gefriertrocknung bzw. Derivatisierung entnommen. Nach der Zentrifugation wurde eine GC-MS durchgeführt, um die Proben zu analysieren. GC-MS-Assays wurden mit Agilent 7890 durchgeführt, ausgestattet mit Agilent 5977-Massendetektor und HP-INNOWax-Säule (30 m × 0,32 mm × 0,25 μm). Als Trägergas wurde hochreines Helium mit einer konstanten Flussrate von 3 ml/min verwendet. Die Temperatur des Säulenkastens wurde zunächst 5 Minuten lang auf 60 °C gehalten, dann mit einer Geschwindigkeit von 10 °C/Minute auf 260 °C erhöht und dann 10 Minuten lang auf 260 °C gehalten. Charakteristische Massensignale von Glucose wurden bei m/z 204 (M + 0), 205 (M + 1), 206 (M + 2) nachgewiesen und dann basierend auf dem Verhältnis von markierten Metaboliten zu unmarkierten berechnet, um verwandte Zwischenprodukte zu analysieren und um das markierte Verhältnis von Glukose in Zellen pro Zeiteinheit zu ermitteln.

Für die Neusequenzierung des gesamten Genoms von SZ3 und SZ17 wurde genomische DNA isoliert und mit dem Nanodrop ND-1000-System (Thermo Scientific, USA) und dem Qubit-Fluorometer (Thermo Scientific, USA) auf Qualität und Konzentration analysiert. Anschließend wurden quantifizierte DNA-Proben fragmentiert, abgestumpft, mit 3ʹ-A-Überhängen modifiziert, mit den Standard-Sequenzierungsadaptern von Illumina ligiert und durch PCR amplifiziert. Die Bibliothek wurde als Paired-End-Reads mit einem Illumina HiSeq 2500-Sequenzer sequenziert. Der Bibliotheksaufbau und die Sequenzierung wurden von Allwegene Tech (Peking, China) durchgeführt. Die Referenzsequenz (Synechococcus elongatus PCC 7942, FACHB-805) wurde von der GenBank für die Lesekartierung erhalten. BWA49 wurde zum Referenzieren von Sequenzen verwendet und SAMtools50 wurde zum Sortieren der Ergebnisse und Markieren doppelter Lesevorgänge verwendet. Anschließend wurden SNPs und Strukturvariationen (SV) zwischen Referenzsequenzen und Probensequenzen von SAMtools bzw. BreakDancer51 identifiziert. Anschließend wurden DNA-Fragmente, die SNPs und SV enthielten, aus der genomischen DNA amplifiziert und durch Sanger-Sequenzierung weiter verifiziert.

Synechococcus-Zellen, kultiviert in Kolben, die unter 50 μmol Photonen/m2/s weißem Fluoreszenzlicht bei 30 °C geschüttelt wurden. Zellen in der logarithmischen Phase wurden geerntet und auf eine OD730 von 4 resuspendiert. Actinomycin D (ActD, 5 μg/ml) wurde zugegeben, um die De-novo-mRNA-Synthese zu blockieren, und Gesamt-RNA wurde zu den angegebenen Zeitpunkten (0, 5, 25 und) isoliert 45 min) nach Zugabe von ActD unter Verwendung eines bakteriellen RNA-Extraktionskits (Vazyme, Nanjing, China). Die RNA-Proben wurden dann unter Verwendung von HiScript III RT SuperMix für qPCR (Vazyme, Nanjing, China) revers in cDNA transkribiert. Quantitative RT-PCR wurde mit einem LightCycler 480-Sequenzdetektor (Roche, Basel, Schweiz; LightCycler 480-Software 1.5) basierend auf SYBR Green I-Fluoreszenz (ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix-Vazyme, Nanjing, China) durchgeführt.

Synechococcus-Zellen, die bis zum 8. Tag unter Standardkultivierungsbedingungen (30 °C, 100 µmol Photonen/m2/s, Lufteinblasen zur Kohlenstoffversorgung) kultiviert wurden, wurden zentrifugiert und dreimal mit einem phosphatgepufferten Salzpuffer gewaschen (ergänzende Abbildung 22). Die Zellpellets wurden 15 Minuten in flüssigem Stickstoff eingefroren und dann bis zur Analyse bei –80 °C gelagert. Anschließend wurden 200 µL ddH2O und 800 µL einer Acetonitril-Methanol-Mischung (1:1) zu 80 mg Zellpellets hinzugefügt. Nach einminütigem Vortexen wurden alle Proben zur Proteinfällung eine Stunde lang bei –20 ° C gelagert. Anschließend wurden die Proben 20 Minuten lang bei 4 °C und 12.000 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde gesammelt und in einem Vakuumkonzentrator zur Trockne eingedampft. Anschließend wurden 100 µL Resuspensionslösung (0,1 % Ameisensäure in ddH2O) zugegeben und 30 s lang gevortext. Die resultierende Lösung wurde durch eine 0,22-µm-Membran filtriert. Um die Qualität der Metabolomics-Analyse sicherzustellen, wurden Qualitätskontrollproben (QC) durch Mischen von sechs Replikaten in jeder Gruppe vorbereitet.

Für die ungezielte Metabolomics-Analyse wurden Proben in einen Agilent 1290 Infinity Ultra-High Performance Liquid Chromatography, ausgestattet mit einer Acquity UPLC BEH Amide-Säule (2,1 mm × 100 mm, 1,7 µm Partikelgröße), injiziert und mit einem AB Triple TOF 5600/6600 detektiert Massenspektrometer, ausgestattet mit einer Elektrospray-Ionisationsquelle (ESI) (AB SCIEX, Kanada). Die Temperatur der Säule wurde auf 25 °C gehalten. Die mobile Gradientenphase war eine Mischung aus 25 mM Ammoniumacetat und 25 mM Ammoniak in Wasser für die mobile Phase A und Acetonitril für die mobile Phase B mit einer Flussrate von 0,30 ml/min. Der Anteil der mobilen Phase B wurde auf 0–0,5 min optimiert, 95 % B; 0,5–7 Min., 95–65 % B; 7,0–8,0 Min., 65–40 % B; 8,0–9,0 Min., 40 % B; 9,0–9,1 Min., 40–95 % B; 9,1–12 Min., 95 % B.

Für die Massenspektrometrieanalyse (MS) wurde ein Scanbereich von 50 bis 1200 m/z (Masse-Ladungs-Verhältnis) gewählt. Die Ionensprühspannung wurde für den positiven Ionisationsmodus (ESI +) auf +5 kV und für den negativen Modus (ESI-) auf -5 kV eingestellt. Die Kollisionsenergie wurde für ESI+ und ESI- auf +15 bzw. –15 eV eingestellt. Die Declustering-Potenziale wurden auf +60 V (ESI+) und –60 V (ESI–) eingestellt und die Quellentemperatur betrug 650 °C. Die rohen LC-MS-Daten wurden von der ProteoWizard-Software konvertiert und zur Peakidentifizierung, -abgleichung und -integration in ein XCMS eingegeben. Identifizierung von Metaboliten durch MS/MS-Spektren mit einer internen Datenbank, die mit verfügbaren authentischen Standards erstellt wurde. Die identifizierten Metaboliten wurden für die Stoffwechselweganalyse weiter anhand der Datenbank Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes durchsucht. Anschließend wurden die Daten durch Pareto-Skalierung für die Hauptkomponentenanalyse, die partielle Diskriminanzanalyse der kleinsten Quadrate (PLS-DA) und die orthogonale partielle Diskriminanzanalyse der kleinsten Quadrate (OPLS-DA) vorverarbeitet. Die eindimensionale statistische Analyse umfasste den Student-t-Test und die Analyse mehrerer Variationen.

Synechococcus-Zellen, die bis zum 4. Tag unter Standardkultivierungsbedingungen (30 °C, 100 µmol Photonen/m2/s, Lufteinblasen zur Kohlenstoffversorgung) kultiviert wurden, wurden zentrifugiert und mit DNase/RNase-freiem Wasser gewaschen (ergänzende Abbildung 23). Zellpellets wurden gesammelt und 15 Minuten lang in flüssigem Stickstoff schnell eingefroren. TRIzol-Reagenz (Invitrogen) wurde für die Gesamt-RNA-Extraktion aus gefrorenen Zellpellets (drei biologische Replikate in jeder Gruppe) verwendet. Die RNA-Qualität und -Konzentration wurden mit dem Nanodrop ND-1000-System (Thermo Scientific, USA) und dem Agilent 2100 RAN NANO 6000 Assay-Kit (Agilent Technologies, CA, USA) analysiert. Paired-End-Bibliotheken wurden mit dem RNA Library Prep Kit (Illumina) erstellt. Die angereicherte mRNA wurde durch Zugabe eines Fragmentierungspuffers fragmentiert und die Erststrang-cDNA wurde unter Verwendung von zufälligen Hexamer-Primern und Reverse Transkriptase synthetisiert, wobei mRNA-Fragmente als Matrizen verwendet wurden, gefolgt von der Zweitstrang-cDNA-Synthese unter Verwendung von DNA-Polymerase I, RNaseH, Puffer und dNTPs. Die synthetisierten doppelsträngigen cDNA-Fragmente wurden dann mit einem QIAQuick PCR-Kit gereinigt. Die gereinigte doppelsträngige cDNA wurde polyadenyliert und mit einem Adapter ligiert, um die Paired-End-Bibliothek herzustellen. Die mit dem Adapter ligierte cDNA und die Adapterprimer wurden für die PCR-Amplifikation verwendet. Schließlich wurde die Illumina-Plattform verwendet, um die resultierenden cDNA-Bibliotheken zu sequenzieren, und es wurden 150-bp-Paired-End-Reads erhalten. Saubere Lesevorgänge wurden von Rohlesevorgängen abgeschnitten, und alle nachgelagerten Analysen basierten auf den sauberen Lesevorgängen. Mithilfe der Bowtie 2-Software wurden Paired-End-Clean-Reads mit dem Referenzgenom von Synechococcus elongatus PCC 7942 abgeglichen. Die Anzahl der jedem Gen entsprechenden Reads wurde mithilfe von FeatureCounts52 berechnet. Anschließend wurden die Fragmente pro Kilobase pro Million (FPKM) jedes Gens basierend auf der Länge des Gens und der diesem Gen zugeordneten Leseanzahl berechnet. Gene mit p-adj <0,05 und |log2foldchange | > log2(1,5) wurden als differentiell exprimierte Gene (DEGs) definiert.

Die Gene Glk1 (Synpcc7942_0221), Glk2 (Synpcc7942_2111) und Fk (Synpcc7942_0116) wurden aus dem PCC 7942-Genom amplifiziert und in pET28a kloniert, wodurch die rekombinanten Expressionsplasmide pYW16, pJS89 bzw. pJS90 erzeugt wurden. Die rekombinanten Plasmide wurden zur Überproduktion von Zielproteinen in den E. coli-Stamm BL21 (DE3) transformiert. Die Transformanten wurden in 500 ml LB-Medium mit 50 μg/ml Kanamycin bei 37 °C gezüchtet. Bei einer OD600 von 0,6–0,8 wurden die Zellen 20 Stunden lang bei 16 °C mit 0,3 mM IPTG induziert. Nach der Induktion wurden die Zellen dann durch Zentrifugation geerntet und durch Ultraschallbehandlung in vorgekühltem Lysepuffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,8) aufgeschlossen. Die Lysate wurden 60 Minuten lang bei 20.000 × g zentrifugiert, und die resultierenden Überstände wurden durch 0,22 μm Polyethersulfonmembranen filtriert und dann zur Affinitätsreinigung auf eine Ni-Sepharose-6-FF-Säule (GE Healthcare, Chicago, IL) geladen. Anschließend wurde das typische Binde-Wasch-Eluieren-Verfahren verwendet, um die Zielproteine ​​zu erhalten. Die Proteinkonzentration in den Fraktionen wurde mit der Bradford-Methode bestimmt und die Reinheit der Zielproteine ​​wurde mit SDS-PAGE untersucht.

Die Phosphorylierungsaktivitäten von Glucokinase und Fructokinase auf verschiedenen Zuckersubstraten wurden mithilfe des enzymgebundenen Pyruvatkinase/Lactatdehydrogenase (PK/LDH)-Assays gemessen, wie zuvor beschrieben, mit Modifikationen53. Kurz gesagt, 20 µL des gereinigten Proteins wurden auf eine 96-Well-Platte übertragen, zu der 210 µL eines Reaktionspuffers (100 mM Tris-HCl, pH 7,8, 2,5 mM ATP, 4 mM MgCl2, 20 mM KCl, 0,3 mM) gegeben wurden NADP+, 10 mM spezifischer Zucker, 1 mM PEP, 1,4 U/ml PK, 2,8 U/ml LDH) wurden zugegeben und die Absorption bei 340 nm wurde alle 15 s während 1 Stunde im Dunkeln gemessen. Die Steigung von A510, die mit der Zeit abnahm, wurde berechnet, und die spezifische Enzymaktivität von Glucokinase/Fructokinase für jeden Zucker wurde mit den Aktivitäten für Glucose/Fructose verglichen, um die relativen Verhältnisse zu erhalten.

Um die genomischen Glucokinase-Sequenzen von Cyanobakterien umfassend zu untersuchen, haben wir mithilfe der NCBI-Datasets-Tools alle verfügbaren genomischen Sequenzen von Cyanobakterien und deren Annotation aus der NCBI-Assembly-Datenbank heruntergeladen. Zur Erstellung der Genomdatenbank wurden insgesamt 986 nicht-redundante Cyanobakteriengenome auf Referenzebene verwendet. Die Genomdatenbank wurde mit dem hmmsearch-Tool des Hmmer-Pakets (Version 3.1b2)54 durchsucht und potenzielle Glucokinase-Sequenzen aus 947 Cyanobakteriengenomen wurden abgerufen, um signifikante Übereinstimmungen mit diesem Glucokinase-HMM (PF02685) mit E-Werten <1–50 (Supplementary) zu zeigen Daten 5).

Synechococcus-Zellen wurden geerntet und mit 17 ml frischem BG11 auf eine anfängliche OD730 von etwa 2,0 resuspendiert. Die Atmungsraten wurden 200 s lang bei 30 °C im Dunkeln gemessen, und die Geschwindigkeit der photosynthetischen Sauerstoffentwicklung in der gesamten Kette wurde 160 s lang bei jeder Lichtstärke (RGB-Lichtquelle) mit dem Photosyntheseinstrument YZQ-201A (Yizongqi Technology Co., Ltd.) gemessen , China) in Gegenwart von 10 mM NaHCO3. Die gesamten photosynthetischen Sauerstoffentwicklungsraten wurden als Netto-Photosyntheserate plus Atmungsrate berechnet.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die in diesem Artikel beschriebenen Datensätze zur Sequenzierung des gesamten Genoms und der Transkriptomsequenzierung sind über den NCBI-BioProject-Zugang PRJNA740138 verfügbar. Alle Rohdaten für die ungezielte Metabolomics-Analyse wurden im CNGB Sequence Archive (CNSA)55 der China National GeneBank DataBase (CNGBdb)56 mit der Zugangsnummer CNP0004406 hinterlegt. Die identifizierten Metaboliten wurden anhand der Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes-Datenbank [https://www.kegg.jp/kegg/kegg2.html] durchsucht. Die Identifizierung der Verbindungen anhand von MS/MS-Spektren wurde mit einer internen Datenbank durchgeführt, die aus verfügbaren authentischen Standards erstellt wurde. Die Referenzgenom- und Genmodell-Annotationsdateien von Synechococcus elongatus PCC 7942 und FACHB-805 wurden von GenBank [https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/GCA/000/012/525/GCA_000012525] bezogen. 1_ASM1252v1/]. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Für alle Skripte verwendete Eingabedatendateien, die generierten Ausgabedateien und das Skript für die Analyse der genomischen Glucokinase-Sequenzen von Cyanobakterien sind auf GitHub [https://github.com/yudifeiluo/cyanobacteria] verfügbar,57.

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Referenzen herunterladen

Die Forschung wurde vom National Key Research and Development Program of China (Grant-Nummer 2021YFA0909700, an XL und GL), der Youth Innovation Promotion Association CAS (an GL), der National Natural Science Foundation of China (Grant-Nummer 32070084 an GL, 32270103 an GL, 32271484 an XL), den DNL Cooperation Fund, CAS (DNL202014, an GL) und das Shandong Taishan-Stipendium (an XL und GL).

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Shanshan Zhang, Jiahui Sun.

Schlüssellabor für Biokraftstoffe, Qingdao-Institut für Bioenergie und Bioprozesstechnologie, Chinesische Akademie der Wissenschaften, Nr. 189 Songling Road, Qingdao, Shandong, 266101, China

Shanshan Zhang, Jiahui Sun, Dandan Feng, Huili Sun, Jinyu Cui, Xuexia Zeng, Yannan Wu, Guodong Luan und Xuefeng Lu

Shandong Energy Institute, Nr. 189 Songling Road, Qingdao, Shandong, 266101, China

Shanshan Zhang, Jiahui Sun, Dandan Feng, Huili Sun, Jinyu Cui, Xuexia Zeng, Yannan Wu, Guodong Luan und Xuefeng Lu

Qingdao New Energy Shandong Laboratory, Qingdao, Shandong, 266101, China

Shanshan Zhang, Jiahui Sun, Dandan Feng, Huili Sun, Jinyu Cui, Xuexia Zeng, Yannan Wu, Guodong Luan und Xuefeng Lu

College of Life Science, Universität der Chinesischen Akademie der Wissenschaften, 100049, Peking, China

Shanshan Zhang, Jiahui Sun, Huili Sun, Guodong Luan und Xuefeng Lu

Dalian National Laboratory for Clean Energy, Dalian, Liaoning, 116023, China

Guodong Luan & Xuefeng Lu

Labor für Meeresbiologie und Biotechnologie, Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology, Qingdao, Shandong, 266237, China

Xuefeng Lu

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GL und XL haben die Forschung entworfen; SZ, JS, DF, XZ, YW, HS, JC und GL führten die Forschung durch; SZ, JS, GL und XL analysierten die Daten; und SZ, JS, GL und XL haben das Manuskript geschrieben.

Korrespondenz mit Guodong Luan oder Xuefeng Lu.

Die Autoren erklären kein konkurrierendes Interesse.

Nature Communications dankt Elton Hudson, Jianping Yu und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Eine Peer-Review-Datei ist verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Zhang, S., Sun, J., Feng, D. et al. Erschließung des Potenzials der Cyanobakterien-Photosynthese zur direkten Umwandlung von Kohlendioxid in Glukose. Nat Commun 14, 3425 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-39222-w

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Eingegangen: 07. Februar 2023

Angenommen: 02. Juni 2023

Veröffentlicht: 09. Juni 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-39222-w

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